Biochemical Genetics Department

Ποσοτικός προσδιορισμός της C26:0-λυσοφωσφατιδυλοχολίνης για τη διάγνωση διαταραχών των υπεροξεισωμάτων  

Το Τμήμα Βιοχημικής Γενετικής έχει πρόσφατα εντάξει και προσφέρει την ανάλυση για τον ποσοτικό προσδιορισμό της C26:0-λυσοφωσφατιδυλοχολίνης (C26:0-lysoPC) στο περιφερικό αίμα. Πρόκειται για μία νέα διαγνωστική υπηρεσία, η οποία πραγματοποιείται με τη μέθοδο υγρής χρωματογραφίας συνοδευόμενη από διαδοχική φασματομετρία μάζας (LC-MS/MS). Ο ποσοτικός προσδιορισμός του μεταβολίτη C26:0-lysoPC είναι σημαντικής διαγνωστικής αξίας, αφού αποτελεί αξιόπιστο και ευαίσθητο βιοδείκτη της συσσώρευσης των λιπαρών οξέων πολύ μακράς αλύσου (very-long-chain fatty acids, VLCFA), ως συνέπεια διαταραχών του μεταβολισμού τους στα υπεροξεισώματα.

Τα υπεροξεισώματα είναι μικρά, σφαιρικά οργανίδια που περιβάλλονται από μονή μεμβράνη, τα οποία εντοπίζονται σε όλα τα ευκαρυωτικά κύτταρα με εξαίρεση τα ώριμα ερυθροκύτταρα. Ένα ανθρώπινο κύτταρο περιέχει 100-1000 υπεροξεισώματα που βρίσκονται κατανεμημένα στο κυτταρόπλασμά του. Τα οργανίδια αυτά περιέχουν ένζυμα που εμπλέκονται σε μία πληθώρα μεταβολικών αντιδράσεων, συμπεριλαμβανομένου και του καταβολισμού (διάσπασης) συγκεκριμένων κατηγοριών λιπαρών οξέων. Τα λιπαρά οξέα αποτελούν μια σημαντική πηγή ενέργειας για τον οργανισμό. Περίπου το 80% των ενεργειακών αναγκών της καρδιάς και του ήπατος των θηλαστικών καλύπτονται από την οξείδωση των λιπαρών οξέων. Αποτελούν επίσης την κύρια πηγή ενέργειας για τους ιστούς στις περιπτώσεις όπου τα αποθέματα γλυκογόνου στο ήπαρ εξαντλούνται. Αν και στην πλειονότητά τους τα λιπαρά οξέα καταβολίζονται στα μιτοχόνδρια, η συμβολή των υπεροξεισωμάτων είναι υψίστης σημασίας, αφού συγκεκριμένες κατηγορίες λιπαρών οξέων οξειδώνονται αποκλειστικά στα οργανίδια αυτά.

Ένα παράδειγμα αποτελούν τα VLCFA, λιπαρά οξέα γραμμικής αλυσίδας με 22 ή περισσότερους άνθρακες, τα οποία είναι και το κύριο υπόστρωμα του μονοπατιού της β-οξείδωσης που λαμβάνει χώρα στα υπεροξεισώματα. Αρχικά, η ανθρακική αλυσίδα των ενεργοποιημένων VLCFA σε μορφή ακυλοσυνενζύμου Α (fatty Acyl-CoA), μεταφέρεται στο εσωτερικό των υπεροξεισωμάτων μέσω μιας πρωτεΐνης-μεταφορέα. Εκεί, υπόκειται σε τέσσερεις ενζυμικές αντιδράσεις (οξείδωση, υδροξυλίωση, αφυδρογόνωση και θειόλυση), οι οποίες οδηγούν στην απελευθέρωση ενός μορίου ακετυλοσυνενζύμου Α και ενός fatty Acyl-CoA, το οποίο είναι μικρότερο κατά δύο άνθρακες από το αρχικό (Εικόνα 1). Ο κύκλος της β-οξείδωσης επαναλαμβάνεται μέχρι το μήκος της ανθρακικής αλυσίδας του λιπαρού οξέος μειωθεί στους 16 άνθρακες, οπότε και συνεχίζει την οξείδωσή του στα μιτοχόνδρια. 

Εικόνα 1: Η β-οξείδωση των λιπαρών οξέων πολύ μακράς αλύσου (very-long-chain fatty acids, VLCFA) στα υπεροξεισώματα. Τα ενεργοποιημένα VLCFA (VLCFA-CoA) μεταφέρονται στο εσωτερικό των υπεροξεισωμάτων μέσω του μεταφορέα ABCD1. Εκεί λαμβάνει χώρα η β-οξείδωση μέσω τεσσάρων διαδοχικών ενζυμικών αντιδράσεων (1. Οξείδωση, 2. Υδροξυλίωση, 3. Αφυδρογόνωση, 4. Θειόλυση), οι οποίες έχουν σαν αποτέλεσμα τη δημιουργία ενός VLCFA-CoA, το οποίο είναι μικρότερο κατά δύο άνθρακες από το αρχικό. Η εικόνα δημιουργήθηκε με το BioRender.com

Οι γενετικές διαταραχές των υπεροξεισωμάτων που χαρακτηρίζονται από συσσώρευση των VLCFA στο αίμα περιλαμβάνουν διαταραχές στη βιογένεσή τους με ελαττωματική συναρμολόγηση των οργανιδίων αυτών καθώς και διαταραχές που προκύπτουν λόγω ανεπάρκειας ενός μεμονωμένου ενζύμου ή άλλης πρωτεΐνης που εμπλέκεται στο μονοπάτι της β-οξείδωσης των υπεροξεισωμάτων. Οι διαταραχές βιογένεσης περιλαμβάνουν τις διαταραχές του φάσματος Zellweger, που κληρονομούνται με αυτοσωμικό υπολειπόμενο τρόπο και κλινικά κατηγοριοποιούνται στο κλασσικό σύνδρομο Zellweger που αποτελεί την πιο σοβαρή μορφή της νόσου, τη νεογνική αδρενολευκοδυστροφία και την παιδική νόσο Refsum. Στις διαταραχές αυτές επηρεάζεται ο σχηματισμός των υπεροξεισωμάτων και ως εκ τούτου όλες οι μεταβολικές διεργασίες που επιτελούνται στα οργανίδια αυτά, συμπεριλαμβανομένης και της β-οξείδωσης των VLCFA. Η κλινική εικόνα των ασθενών παρουσιάζει αυξημένη ετερογένεια, με τα πιο κύρια χαρακτηριστικά να περιλαμβάνουν αναπτυξιακή καθυστέρηση, ιδιόμορφα χαρακτηριστικά προσώπου, δυσλειτουργία του ήπατος καθώς και διαταραχές στην ακοή και στην όραση. Η φυλοσύνδετη αδρενολευκοδυστροφία (X-linked adrenoleukodystrophy) αποτελεί την πιο συχνή διαταραχή των υπεροξεισωμάτων και οφείλεται  σε μεταλλάξεις στο γονίδιο (ABCD1) που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη που είναι υπεύθυνη για την μεταφορά των VLCFA στο εσωτερικό των υπεροξεισωμάτων, με αποτέλεσμα την ανεπαρκή οξείδωσή τους και τη συσσώρευσή τους στο αίμα. Η διαταραχή αυτή χαρακτηρίζεται από μεγάλη ετερογένεια ως προς την ηλικία έναρξης και τη σοβαρότητα των συμπτωμάτων. Οι ασθενείς που πάσχουν από την πιο σοβαρή μορφή της νόσου παρουσιάζουν διαταραχές στη συμπεριφορά και των γνωστικών λειτουργιών καθώς και προοδευτικό νευροεκφυλισμό. Ως φυλοσύνδετη ασθένεια, επηρεάζει κυρίως άνδρες και νεαρά αγόρια, παρ’ όλα αυτά ένα ποσοστό της τάξεως του 80% γυναικών φορέων της νόσου παρουσιάζουν κάποια συμπτώματα σε μεγαλύτερες ηλικίες. 

Ο ποσοτικός προσδιορισμός του C26:0-lysoPC διενεργείται σε δείγμα αίματος  με τη μέθοδο υγρής χρωματογραφίας υπερυψηλής απόδοσης συνοδευόμενη από διαδοχική φασματομετρία μάζας. Αρχικά το δείγμα υπόκειται σε χρωματογραφικό διαχωρισμό, ο οποίος πραγματοποιείται δια μέσου στήλης, κατάλληλης για πολύ υδρόφοβα μόρια όπως είναι τα VLCFA. Στη συνέχεια ακολουθεί η ανίχνευση των μορίων σε μορφή ιόντων με διαδοχική φασματομετρία μάζας. Ο ιονισμός πραγματοποιείται με ηλεκτροψεκασμό (electrospray ionization) και η ταυτοποίηση του C26:0-lysoPC επιτυγχάνεται με βάση το λόγο της μάζας προς το φορτίο (m/z) του πρόδρομου ιόντος και του θραύσματος που προκύπτει από τη διάσπασή του (636.50>104.10). Για τον υπολογισμό της συγκέντρωσης του C26:0-lysoPC στο δείγμα χρησιμοποιείται δευτεριωμένο ισότοπο (C26:0-d4-lysoPC) γνωστής συγκέντρωσης (Εικόνα 2). Ο χρόνος ανάλυσης για κάθε δείγμα είναι τα 12 λεπτά. 

Εικόνα 2: Η κορυφή που αντιστοιχεί στο C26:0-lysoPC (Α) σε ένα φυσιολογικό δείγμα και (Β) σε ένα δείγμα ασθενούς με κλασσικό σύνδρομο Zellweger. Η συγκέντρωση του C26:0-lysoPC είναι ανάλογη του εμβαδού της χρωματογραφικής κορυφής.

Ανθή Δημητριάδου, PhD
Associate Scientist 
Τμήμα Βιοχημικής Γενετικής