Molecular Genetics Thalassaemia Department

«Fast COLD PCR» για την β-θαλασσαιμία

Η β-θαλασσαιμία είναι η πιο κοινή αυτοσωμική υπολειπόμενη κληρονομική ασθένεια στην Κύπρο, με συχνότητα φορέων 12%.
ΕΡΕΥΝΑ
____
 

Μη-επεμβατικός προγεννητικός έλεγχος για την β-θαλασσαιμία

 

Η β-θαλασσαιμία είναι η πιο κοινή αυτοσωμική υπολειπόμενη κληρονομική ασθένεια στην Κύπρο, με συχνότητα φορέων 12%. Το γεγονός αυτό ωθεί τα περισσότερα ζευγάρια στην Κύπρο να προβαίνουν σε προγεννητικό έλεγχο για την β-θαλασσαιμία ο οποίος μέχρι στιγμής γίνεται επεμβατικά με την χρήση δείγματος από τον πλακούντα του εμβρύου. Η πρόσφατη ανακάλυψη της παρουσίας εξωκυτταρικού εμβρυϊκού DNA στην κυκλοφορία της μητέρας άνοιξε νέους ορίζοντες στο πεδίο της προγεννητικής διάγνωσης (Εικόνα 1). 

Ο κύριος στόχος της εργαστηριακής μου έρευνας είναι η ανάπτυξη μιας αξιόπιστης μη-επεμβατικής μεθόδου για την προγεννητική διάγνωση της β-θαλασσαιμίας με τη χρήση μητρικού πλάσματος. Η καινοτομία της ερευνητικής μας πρότασης οδήγησε στο να επιλεχθεί μέσα από πολλές για να χρηματοδοτηθεί από το Telethon το 2015 για διάρκεια τριών ετών. Το ξεκίνημα της έρευνάς μου έγινε με την χρήση της εναλλακτικής μεθόδου «Fast COLD PCR». Κατά τη μέθοδο αυτή,  εμπλουτίζονται επιλεκτικά τα αλληλόμοφα που βρίσκονται σε μειονότητα όπως είναι τα εμβρυϊκά αλληλόμορφα που έχουν κληρονομηθεί από τον πατέρα. Η εφαρμογή της μεθόδου αυτής στο εργαστήριό μας, κατέδειξε τον επιτυχή εμπλουτισμό των εμβρυϊκών αλληλομόρφων αλλά με ανεπιτυχή  επαναληψιμότητα. Μετά από πολλές δοκιμές και προσπάθειες, αναπτύξαμε την δική μας τροποποιημένη έκδοση της Fast COLD PCR, με όνομα Fast Temperature-Gradient COLD PCR. Έτσι, καταφέραμε με επαναληψιμότητα τον εμπλουτισμό των πατρικά κληρονομούμενων εμβρυϊκών αλληλομόρφων τυποποιώντας  πρωτόκολλα για δύο πολυμορφισμούς. 

Τα πρωτόκολλα αυτά  εφαρμόστηκαν σε 17 δείγματα μητρικού πλάσματος όπου καταφέραμε να ανιχνεύσουμε με ακρίβεια και επαναληψιμότητα τα πατρικά κληρονομούμενα αλληλόμορφα σε όλα τα δείγματα που εξετάστηκαν, επιτυγχάνοντας εμπλουτισμό μέχρι και στο μέγιστο (100%). Ο εμβρυϊκός γονότυπος έχει καθοριστεί με επιτυχία για όλα τα δείγματα που εξετάστηκαν με Fast Temperature-Gradient COLD PCR, σε αντίθεση με την ανάλυση των ίδιων δειγμάτων με συμβατικό PCR όπου τα εμβρυϊκά αλληλόμορφα ήταν μη ανιχνεύσιμα (Εικόνα 2). Τα αποτελέσματα αυτά είναι σε πλήρη συμφωνία με αυτά των αντίστοιχων δειγμάτων πλακούντα του εμβρύου, επιτυγχάνοντας έτσι υψηλή ακρίβεια. Τα τυποποιημένα πρωτόκολλά μας μπορούν να αποτελέσουν μοντέλο για τον εμπλουτισμό άλλων αλληλομόρφων που βρίσκονται σε μειονότητα, όπως του ελεύθερου κυκλοφορούντος καρκινικού DNA (circulating free tumor DNA, cftDNA) στο πλάσμα των ασθενών.   

Παραμένοντας επικεντρωμένοι στην ανάπτυξη μη-επεμβατικής προγεννητικής διάγνωσης για την β-θαλασσαιμία, βρισκόμαστε παράλληλα στο τελικό στάδιο του σχεδιασμού βιβλιοθήκης Στοχευμένης Αλληλούχισης Νέας Γενιάς η οποία περιλαμβάνει περίπου 250 πολυμορφισμούς που βρίσκονται στην συστάδα γονιδίων της β-σφαιρίνης. Στόχος της προσέγγισης αυτής είναι η ανίχνευση τόσο των πατρικά όσο και των μητρικά κληρονομούμενων  εμβρυϊκών αλληλομόρφων. Σύντομα, θα έχω την ευκαιρία να εκπαιδευτώ στην μέθοδο αυτή και να αναλύσω σημαντικό αριθμό δειγμάτων εξωκυταρικού DNA από μητρικό πλάσμα και γενωμικό DNA από περιφερικό αίμα. Για τον σκοπό αυτό, θα μεταβώ στο Erasmus Center for Biomics, Erasmus Medical Centre (EMC), Rotterdam στην Ολλανδία όπου και θα πραγματοποιήσω μέρος της έρευνάς μου.

Ταυτόχρονα, οι έρευνές μας επεκτείνονται και στην χρήση μιας άλλης καινοτόμου μεθόδου, της Droplet Digital PCR. Το χαρακτηριστικό της μεθόδου αυτής είναι ο διαχωρισμός μονήρων μορίων DNA σε μεγάλο αριθμό σταγονιδίων με αποτέλεσμα την απόλυτη ποσοτικοποίηση του DNA. Στο εργαστήριό μας, χρησιμοποιούμε τη μέθοδο αυτή εξετάζοντας δύο προσεγγίσεις. Η μία προσέγγιση στοχεύει την αξιόπιστη μέτρηση των αναλογιών των μητρικών και εμβρυϊκών αλληλομόρφων που υπάρχουν στο μητρικό πλάσμα, με σκοπό την ανίχνευση των μητρικά κληρονομούμενων εμβρυϊκών αλληλομόρφων. Με τη βελτιστοποίηση της προσέγγισης αυτής, η μη-επεμβατική προγεννητική διάγνωση για την β-θαλασσαιμία θα έχει εφαρμογή στο 100% των περιπτώσεων που αποτίθενται για μη-επεμβατικό προγεννητικό έλεγχο. Η δεύτερη προσέγγιση έχει ως στόχο τον καθορισμό των απλοτύπων και της φάσης των αλληλομόρφων ενός ατόμου, χωρίς την ανάγκη δειγμάτων γενετικού υλικού από την οικογένειά του. Έτσι, οποιαδήποτε εξέταση βασισμένη στην ανάλυση απλοτύπων θα είναι εφικτή και  για τις περιπτώσεις όπου το γενετικό υλικό της οικογένειας δεν είναι διαθέσιμο.    

Η ένταξή μου στην σχολή Μοριακής Ιατρικής Κύπρου ως διδακτορική φοιτήτρια μου έδωσε την ευκαιρία να ειδικευτώ σε υψηλής τεχνολογίας μεθόδους όπως Fast COLD PCR, Droplet Digital PCR και στον σχεδιασμό βιβλιοθήκης για Στοχευμένη Αλληλούχιση Νέας Γενιάς (Εικόνα 3). Έτσι, έχω αποκτήσει μεγαλύτερη εμπειρία στο πεδίο της μοριακής ιατρικής, αφού έχω αναπτύξει έναν διαφορετικό τρόπο σκέψης γύρω από την έρευνα. Οι δεξιότητες που απέκτησα μέσα από τις σπουδές μου, μου επιτρέπουν επίσης να επιβλέπω φοιτητές και μαθητές που επισκέπτονται κατά καιρούς το εργαστήριό μας για την διεκπεραίωση των πειραμάτων τους. 

Κατά την διάρκεια των σπουδών μου είχα επίσης την τιμή να επιλεχθώ μέσα από πολλούς αξιόλογους ερευνητές για να συμμετάσχω ως προσκεκλημένη ομιλήτρια στο επιστημονικό συνέδριο “Cambridge Healthtech Institute’s 5th Int’l Molecular Diagnostics Europe” στην Λισαβόνα και να παρουσιάσω μέρος της δουλειάς μου. Από το ταξίδι αυτό αποκόμισα πολλά αφού ήρθα σε επαφή με αξιόλογους επιστήμονες και απέκτησα περισσότερες γνώσεις στο πεδίο της μη-επεμβατικής προγεννητικής διάγνωσης που θα με βοηθήσουν στην εξέλιξη της διατριβής μου. 

Εικόνα 1. Εξωκυτταρικό εμβρυϊκό DNA στην μητρική κυκλοφορία. (http://harroulabilali.gr), (http://slideplayer.com/slide/4463148)

 
 
Εικόνα 2.  Ανίχνευση με αλληλούχιση Sanger των εμπλουτισμένων πατρικά κληρονομούμενων εμβρυϊκών αλληλομόρφων για 2 πολυμορφισμούς σε δείγμα μητρικού πλάσματος μετά από την μέθοδο fast TG COLD PCR (πάνω) και αδυναμία ανίχνευσης των εμβρυΪκών αλληλομόρφων του ίδιου δείγματος μετά από συμβατικό PCR (κάτω).

Εικόνα 3. Αξιολόγηση σχεδιασμού βιβλιοθήκης για Στοχευμένη Αλληλούχιση Νέας Γενιάς μέσω του UCSC genome browser. 

 

 
 

Στεφανία Μπύρου
Διδακτορική Φοιτήτρια στο πρόγραμμα Μοριακής Ιατρικής
Τμήμα Θαλασσαιμίας

 

 

Related Articles
winner