Molecular Genetics Thalassaemia Department

Οι αιμοσφαιρινοπάθειες είναι οι πιο κοινές μονογονιδιακές ασθένειες και θεωρούνται παγκοσμίως ως μια αυξανόμενη πρόκληση για την υγεία. Η θαλασσαιμία αποτελεί ένα σοβαρό πρόβλημα υγείας στην Κύπρο με το 12% του πληθυσμού να είναι φορείς β-θαλασσαιμίας και περίπου το 19% φορείς α-θαλασσαιμίας.

Η παραδοσιακή στρατηγική για τη μοριακή διάγνωση της θαλασσαιμίας σχεδιάστηκε για να προσδιορίσει τις πιο κοινές μεταλλάξεις ή να στοχεύσει τα κύρια γονίδια που προκαλούν τη θαλασσαιμία, HBA1, HBA2 και HBB. Ο μοριακός έλεγχος, συνήθως περιλαμβάνει μια σειρά από μεθόδων για τον έλεγχο όλων των πιθανών παραλλαγών όπως οι συμβατικές μοριακές τεχνικές, RT-PCR, GAP-PCR, Real-Time PCR, MLPA, Sanger sequencing και Mini sequencing. 

Ακολουθώντας τη στρατηγική της πολύπλοκης ανάλυσης, με τη χρήση πολλαπλών διαφορετικών τεχνικών για την εξαγωγή ενός αποτελέσματος, η διαδικασία για την  οριστική διάγνωση μπορεί να είναι δύσκολη, παρατεταμένη και ίσως ανέφικτη, και την ίδια στιγμή δαπανηρή. Ως εκ τούτου, η ανάγκη για ένα ολιστικό τρόπο προσέγγισης ήταν εξαίρετης σημασίας. 

Η κατακόρυφη ανάπτυξη μοριακών τεχνολογιών συμπεριλαμβανομένης της Αλληλούχησης  Νέας Γενιάς/Next Generation Sequencing (NGS), μας ενέπνευσε να αξιοποιήσουμε και να αναπτύξουμε αυτή την τεχνολογία για την αντικατάσταση του περίπλοκου συμβατικού μοριακού ελέγχου με μια ολοκληρωμένη και περιεκτική ανάλυση της θαλασσαιμίας. Αυτό πραγματοποιήθηκε με την καθιέρωση ενός τέστ βασισμένο στο NGS για την ταυτόχρονη γενετική ανάλυση όλων των παραλλαγών στις συστάδες γονιδίων HBA και HBB (Εικόνα 1).

Για τον σκοπό αυτό αξιολογήθηκε το στοχευμένο για τη Θαλασσαιμία NGS kit (NGS-Thalassemia kit), το οποίο εξετάζει το σύμπλεγμα άλφα και βήτα σφαιρίνης (HBA1, HBA2 και HBB). Είναι δοκιμασία NGS ενός σωλήνα (single-tube) για ταυτόχρονη ολοκληρωμένη ανάλυση των συστάδων γονιδίων HBA1, HBA2 και HBB, για πολλά δείγματα σε μία μόνο δοκιμή. Η πλήρης γονιδιακή αλληλουχήση των γονιδίων HBA1, HBA2 και HBB επιτρέπει την ανίχνευση όλων των SNVs. Το kit χρησιμοποιεί δύο ανεξάρτητες μεθόδους παράλληλης ανίχνευσης CNV με δύο συνδυασμένες στρατηγικές: τη στοχευμένη ανίχνευση 17 CNVs (direct CNV detection με GAP-PCR) και την ανίχνευση CNV, βάσει κάλυψης (coverage based) στις συστάδες άλφα και βήτα σφαιρίνης(Εικόνα 2). Η επαληθευμένη και ακριβής ανάλυση του CNV, δεδομένων των δυσκολιών ανίχνευσης τους, καθιστά τη μέθοδο αυτή αξιόπιστη και ισχυρή. Για την αρχική αξιολόγηση χρησιμοποιήθηκαν 25 δείγματα DNA με γνωστούς γονότυπους, που είχαν προηγουμένως χαρακτηριστεί στο εργαστήριό μας. Αφού είχαμε ενθαρρυντικά αποτελέσματα προχωρήσαμε στην επικύρωση της μεθόδου πριν την εφαρμογή στην κλινική ρουτίνα. Για τη μελέτη επικύρωσης, χρησιμοποιηθήκαν 100 δείγματα DNA τα οποία αναλύθηκαν με το kit NGS-Thalassaemia, παράλληλα με τις σχετικές συμβατικές μοριακές μεθόδους. 

Μία προσαρμοσμένη σειρά βιοπληροφορικού λογισμικού, το Amplicon Suite (SmartSeq®) επιτρέπει την ανάλυση δεδομένων κατά την οποία τα SNVs, τα indels και CNVs αναλύονται γρήγορα και εμφανίζονται διαισθητικά.  Είναι άμεσα συνδεδεμένο και ενημερωμένο με βάσεις δεδομένων όπως το IthaNet, ClinVar, dbSNP, GnomAD για έγκυρη ταξινόμηση των παραλλαγών, βοηθώντας έτσι στην κλινική ερμηνεία των αποτελεσμάτων.

Η αρχική αξιολόγηση της μοριακής ανάλυσης θαλασσαιμίας NGS έδειξε τη δύναμη της ανάλυσης για την ακριβή ανίχνευση όλων των παραλλαγών στα αναλυθέντα γονίδια. Επιπλέον, η NGS ανάλυση εντόπισε παραλλαγές που δεν ήταν προηγουμένως αναγνωρίσιμες από τη συμβατική στρατηγική πολλών από τις μεθόδους που εφαρμόζαμε προηγουμένως. Έτσι, αποδείξαμε τη δυνατότητα πλήρους ανάλυσης της θαλασσαιμίας μέσω της μεθόδου αυτής. Η δοκιμή στέφθηκε με επιτυχία: τα αποτελέσματα που ελήφθησαν από τη δοκιμασία NGS ήταν σε πλήρη συμφωνία με τα αποτελέσματα από παράλληλη ανάλυση με την τυπική στρατηγική μας. 

Ως εκ τούτου, η ανάλυση θαλασσαιμίας έχει αντικατασταθεί πλήρως με τη δοκιμασία NGS-Thalassaemia και εφαρμόζεται με επιτυχία από το 2020 στο εργαστήριό μας. Με τη μετατροπή αυτή παρέχουμε μια ολοκληρωμένη γενετική ανάλυση Θαλασσαιμίας, όπου είναι δυνατή η ταυτόχρονη ανίχνευση HBA1, HBA2, HBB, SNVs και CNVs. Η απλή και γρήγορη ροή εργασίας επιτρέπει την πολυπλεξία έως και 48 δειγμάτων σε ένα σωλήνα (single tube analysis). Η καινοτόμα αυτή μέθοδος είναι ταυτόχρονα επωφελής για το εργαστήριο, τους γιατρούς και το σημαντικότερο τους ασθενείς. 

Με την παρέλευση του χρόνου, καταφέραμε να αναδείξουμε ότι η επίδραση αυτής της ολοκληρωμένης δοκιμής NGS ήταν τεράστια/τεράστιας σημασίας, επιδεικνύοντας ισχυρά στοιχεία για να κερδίσουμε θετική ανταπόκριση από οργανισμούς και ιατρούς, συσσωρεύοντας έτσι εμπιστοσύνη με την πάροδο του χρόνου.

Με στόχο τη διασφάλιση και διατήρηση της βέλτιστης ποιότητας των γενετικών αναλύσεων  και εκθέσεων, προς όφελος των ασθενών, το Τμήμα Μοριακής Γενετικής Θαλασσαιμίας έχει λάβει το 2014 από τον Κυπριακό Οργανισμό Προώθησης Ποιότητας (ΚΟΠΠ) το πρότυπο διαπίστευσης ISO 15189:2012, ενώ πρόσφατα έχει συμπεριληφθεί και η μέθοδος NGS-thalassaemia στο πεδίο διαπίστευσης του τμήματος. Συμμετέχει με επιτυχία σε ευρωπαϊκά διεργαστηριακά προγράμματα GenQA/EMQN/UKNEQAS για την αξιολόγηση των γενετικών αναλύσεων και τη διασφάλιση της ποιότητας. Ακολουθεί τις κατευθυντήριες γραμμές και οδηγίες βέλτιστης πρακτικής όπως καθορίζονται από το Eυρωπαϊκό Δίκτυο Μοριακής Ποιότητας (EMQN). Το τμήμα είναι ενεργό μέλος του Ευρωπαϊκού Δικτύου Αναφοράς ERN-EuroBloodNet για σπάνια αιματολογικά νοσήματα.

Το τμήμα Μοριακής Γενετικής Θαλασσαιμίας του Ινστιτούτου Νευρολογίας & Γενετικής Κύπρου με διευθύντρια την Δρ Μαρίνα Κλεάνθους, εφαρμόζει και προσφέρει τη νέα γενετική διαγνωστική μέθοδο NGS από το 2020. Την ομάδα απαρτίζουν η Δρ Θεσσαλία Παπασάββα, υπεύθυνη της διαγνωστικής ομάδας του Τμήματος, ο Γιώργος Χριστόπουλος, η Μιράντα Πέτρου, η Ξένια Φελέκη, και η Ελένη Καριτζή.

Δρ Θεσσαλία Παπασάββα
Μοριακός Γενετιστής

Εικόνα 1. Διάγραμμα ροής της στρατηγικής μοριακών δοκιμών που χρησιμοποιείται στο εργαστήριο μας για την μοριακή ανάλυση της θαλασσαιμίας το οποίο αντικαταστάθηκε από το ολοκληρωμένο kit, NGS-Thalassaemia.

Εικόνα 2. Γραφική αναπαράσταση στοχευμένων περιοχών και καλυμμένων θέσεων στις συστάδες γονιδίων άλφα και βήτα σφαιρίνης.