Molecular Genetics Thalassaemia Department

Προς καινούριες διαγνωστικές και θεραπευτικές προσεγγίσεις διαταραχών της ερυθροποίησης: miRNAs στη ρύθμιση της ερυθροποίησης και της σύνθεσης της γ-σφαιρίνης

Προφίλ έκφρασης και δίκτυα miRNA διαχωρίζουν διαφορετικές πηγές ερυθροποιητικών κυττάρων και την εμβρυϊκή από την ενήλικη ερυθροποίηση

Οι β-αιμοσφαιρινοπάθειες αποτελούν ομάδα μονογονιδιακών διαταραχών της αιμοσφαιρίνης που κληρονομούνται με αυτοσωμικό υπολειπόμενο χαρακτήρα και είναι ιδιαίτερα συχνές στη χώρα μας, με τη συχνότητα των φορέων να ανέρχεται περίπου στο 12% του πληθυσμού. Οι β-αιμοσφαιρινοπάθειες οφείλονται σε περισσότερες από 400 μεταλλάξεις που προκαλούν μειωμένη ή μηδενική σύνθεση των αλυσίδων β-σφαιρίνης, οι οποίες μαζί με τις αλυσίδες α-σφαιρίνης σχηματίζουν την αιμοσφαιρίνη ενηλίκου (ΗbA: α2β2).  Η έλλειψη της β-σφαιρίνης έχει ως αποτέλεσμα την περίσσεια αλυσίδων α-σφαιρίνης που κατακρημνίζονται στους ερυθροβλάστες οδηγώντας σε μη αποδοτική ερυθροποίηση, πρόωρη καταστροφή των ερυθροκυττάρων (αιμόλυση) και κατά συνέπεια αναιμία στον ασθενή. Στις σοβαρές μορφές της νόσου, η επιβίωση των ασθενών εξαρτάται από τακτικές μεταγγίσεις αίματος σε συνδυασμό με αποσιδήρωση, ενώ μια πληθώρα συστηματικών επιπλοκών μειώνει την ποιότητα ζωής και το προσδόκιμο επιβίωσής τους. Η επαγωγή της εμβρυϊκής γ-σφαιρίνης έχει αποδειχθεί ότι βελτιώνει τον φαινότυπο της νόσου, καθώς η γ-σφαιρίνη αντισταθμίζει την έλλειψη β-σφαιρίνης και αμβλύνει τη συμπτωματολογία της νόσου. Ως εκ τούτου, η επίτευξη της επαγωγής της εμβρυϊκής γ-σφαιρίνης σε κλινικά θεραπευτικά επίπεδα αποτελεί αντικείμενο εντατικής έρευνας. Η έρευνα στο προκλινικό στάδιο περιλαμβάνει πειράματα και δοκιμές σε κυτταρικά μοντέλα τα οποία είναι είτε «αθάνατες» κυτταρικές σειρές είτε πρωτογενή κύτταρα προερχόμενα κατευθείαν από ασθενείς ή υγιείς εθελοντές.

Στο πλαίσιο της ερευνητικής μας προσπάθειας για επαγωγή της γ-σφαιρίνης, μελετήσαμε τη συμμετοχή μικρών μορίων RNA, γνωστών ως miRNAs, στα μονοπάτια που εμπλέκονται στη ρύθμιση της γ-σφαιρίνης. Για τον σκοπό αυτό αναλύσαμε την έκφραση των miRNAs κατά τη διάρκεια της ερυθροειδικής διαφοροποίησης δύο ευρέως χρησιμοποιούμενων ερυθροειδικών κυτταρικών σειρών (HUDEP-1 και HUDEP-2) καθώς και πρωτογενών προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων (CD34+) που απομονώθηκαν από το περιφερικό αίμα υγιών εθελοντών. Παρόλη την κοινή προέλευση των κυτταρικών σειρών —ΗUDEP-1 και HUDEP-2 προέρχονται και οι δύο από κύτταρα αίματος ομφάλιου λώρου—η πρώτη αποτελεί μοντέλο εμβρυϊκής ερυθροποίησης, εκφράζοντας γ-σφαιρίνη, ενώ η δεύτερη μοντέλο ενήλικης ερυθροποίησης, εκφράζοντας β-σφαιρίνη (Σχήμα 1a). Από δείγματα κυττάρων στην αρχή και στο τέλος της ερυθροειδικής διαφοροποίησης απομονώθηκαν μικρά μόρια RNA τα οποία αναλύθηκαν με Aλληλούχιση Nέας Γενιάς (Next Generation Sequencing) με τη μέθοδο DNA Nanoball small RNA sequencing στην πλατφόρμα BGI-SEQ500. Η ανάλυση της διαφορικής έκφρασης γνωστών αλλά και νέων miRNAs μεταξύ αρχικού και τελικού σταδίου της διαφοροποίησης ανέδειξε miRNAs με ειδική δράση στην ερυθρά σειρά, δηλαδή miRNAs που εμφανίζουν αύξηση (erythromiRs) ή μείωση της έκφρασής τους κατά την ερυθροποίηση, όπως επίσης και τα γονίδια-στόχους τους και τα μονοπάτια που εμπλέκονται και ρυθμίζουν τη διαδικασία αυτή. Η ανάλυση της διαφορικής έκφρασης των miRNAs μεταξύ κυτταρικών σειρών HUDEP και πρωτογενών κυττάρων ανέδειξε ομοιότητες που δικαιολογούν τη χρήση των κυττάρων HUDEP ως ισοδύναμα μοντέλα των πρωτογενών (Σχήμα 1b, 1c) αλλά και διαφορές που σχετίζονται κυρίως με τη διαδικασία «αθανατοποίησης» των κυτταρικών σειρών. Τέλος, η σύγκριση του προφίλ έκφρασης των miRNAs μεταξύ HUDEP-1 και HUDEP-2, ανέδειξε miRNAs που πιθανώς εμπλέκονται στη ρύθμιση της παραγωγής της γ-σφαιρίνης, καθώς και τα γονίδια-στόχους και τα μονοπάτια στα οποία δρούνε. Περαιτέρω ανάλυση των δεδομένων σε δίκτυα χρησιμοποιώντας online υπολογιστικά εργαλεία και βάσεις δεδομένων, αποκάλυψε τη συμμετοχή στα δίκτυα αυτά γονιδίων και μεταγραφικών παραγόντων (transcription factors) με γνωστή αλλά και άγνωστη έως τώρα δράση στην παραγωγή της γ-σφαιρίνης, καθώς και τη συμμετοχή άλλων μορίων της κατηγορίας non-coding RNAs όπως τα long non-coding RNAs (Σχήμα 2). Οι συνδέσεις στα δίκτυα αυτά ανέδειξαν την πολυπλοκότητα τέτοιων πολυδιάστατων ρυθμιστικών δικτύων που ελέγχουν σύνθετες βιολογικές διεργασίες όπως είναι η ερυθροποίηση και η παραγωγή της αιμοσφαιρίνης, υπογραμμίζοντας την ανάγκη για ανάπτυξη συνδυαστικών θεραπειών, τουλάχιστον σε ότι αφορά θεραπείες που βασίζονται σε miRNAs.

Η μελέτη αυτή αναλύει για πρώτη φορά την έκφραση των miRNAs στην κυτταρική σειρά HUDEP, που αποτελεί τα τελευταία χρόνια το κατεξοχήν κυτταρικό μοντέλο της ερυθροποίησης, και συγκρίνει το προφίλ έκφρασής τους με αυτό στα πρωτογενή CD34+ κύτταρα. Τα αποτελέσματα της μελέτης επιβεβαιώνουν ευρήματα προηγούμενων μελετών σε ότι αφορά τη συμμετοχή συγκεγκριμένων γνωστών miRNAs στην ερυθροποίηση και τη ρύθμιση της γ-σφαιρίνης, ενώ επιπλέον υποδεικνύουν και άλλα, προηγουμένως χαρακτηρισμένα miRNAs, ως εμπλεκόμενα στις διεργασίες αυτές για πρώτη φορά. Ακόμα πιο σημαντικό, η μελέτη ταυτοποιεί καινούρια (novel) miRNAs (τουλάχιστον τρία με υψηλή έκφραση), η περαιτέρω διερεύνηση των οποίων παρουσιάζει εξαιρετικό ενδιαφέρον. 

Συμπερασματικά, η μελέτη αυτή φωτίζει αρκετές πτυχές της ρυθμιστικής δράσης των miRNAs, υποδεικνύοντας γονίδια, μονοπάτια και δίκτυα βιολογικών παραγόντων τα οποία στοχεύονται από τα miRNAs αυτά. Λειτουργικές μελέτες για την επιβεβαίωση της βιολογικής λειτουργίας και εξακρίβωση του ακριβούς μηχανισμού δράσης των miRNAs αυτών θα βοηθήσουν στην ανάπτυξη νέων διαγνωστικών, με βάση τα miRNA ως βιοδείκτες, αλλά και θεραπευτικών προσεγγίσεων, τόσο για τις αιμοσφαιρινοπάθειες, όσο και για άλλες διαταραχές της ερυθροποίησης.
Η μελέτη έχει δημοσιευτεί στο επιστημονικό περιοδικό «International Journal of Molecular Sciences». https://doi.org/10.3390/ijms22073626 

Δρ Παναγιώτα Παπασάββα
Απόφοιτος Μάστερ της Σχολής Μοριακής Ιατρικής Κύπρου 
Υποψήφια Διδάκτορας 
Τμήμα Μοριακής Γενετικής Θαλασσαιμίας Ινστιτούτο Νευρολογίας & Γενετικής Κύπρου

Σχήμα 1. a Ανάλυση της έκφρασης των σφαιρινών στο τέλος της ερυθροειδικής διαφοροποίησης με υγρή χρωματογραφία υψηλής επίδοσης (RP-HPLC). Επισημειώνονται στις κορυφές οι αντίστοιχες σφαιρίνες. b Υποπληθυσμοί ερυθροειδικών κυττάρων (από τo αρχικό στάδιο διαφοροποίησης (Pro) μέχρι το τελικό (Ret)) όπως εκτίμηθηκαν μορφολογικά στα δείγματα με μικροσκοπία μετά από ειδική χρώση. c Ανάλυση κυρίων συνιστωσών (principal component analysis) της έκφρασης όλων των ταυτοποιηθέντων miRNAs στα δείγματα (παρουσιάζονται οι δύο πρώτες κύριες συνιστώσες (PC1, PC2). Ως _Ε και _L χαρακτηρίζονται τα δείγματα αρχικού (ΕARLY) και τελικού (LATE) σταδίου ερυθροειδικής διαφοροποίησης, αντίστοιχα.

Σχήμα 2. Δίκτυα miRNA-μεταγραφικών παραγόντων που αναδεικνύουν τη συνεργιστική δράση των miRNAs στη ρύθμιση της παραγωγής γ-σφαιρίνης. a Δίκτυο miRNA-μεταγραφικών παραγόντων για miRNAs που παρουσιάζουν αυξημένη έκφραση στα HUDEP-1 κύτταρα. b Δίκτυο miRNA-μεταγραφικών παραγόντων για miRNAs που παρουσιάζουν αυξημένη έκφραση στα HUDEP-2 κύτταρα. Τα δίκτυα κατασκευάστηκαν στην πλατφόρμα miRNet (https://www.mirnet.ca/).