Molecular Genetics Thalassaemia Department

Η β-θαλασσαιμία αποτελεί μία από τις πιο συχνές μονογονιδιακές ασθένειες παγκοσμίως. Προκαλείται από μεταλλάξεις στο γονίδιο της β-σφαιρίνης που οδηγούν στη μείωση ή απουσία σύνθεσης της β-σφαιρίνης, βασικού συστατικού του μορίου της αιμοσφαιρίνης ενηλίκου (ΗbA2, α2β2). Η ανεπαρκής ποσότητα HbA2 και η ανισορροπία μεταξύ β- και α-τύπου αλυσίδων σφαιρίνης στα ερυθροκύτταρα, οδηγεί σε μη-αποδοτική ερυθροποίηση, αυξημένη αιμόλυση και εντέλει στην ανάπτυξη αναιμίας. Μέχρι στιγμής έχουν χαρακτηρισθεί περισσότερες από 300 διαφορετικές υπολειπόμενες μεταλλάξεις β-θαλασσαιμίας στο γονίδιο της β-σφαιρίνης, οι οποίες ευθύνονται για ένα ευρύ φάσμα φαινοτύπων της νόσου, που περιλαμβάνει από ασυμπτωματική αναιμία (ήπια ή ελάσσονα) έως σοβαρή και δυνητικά θανατηφόρα εξαρτώμενη από μεταγγίσεις αναιμία (ενδιάμεση και μείζονα).

Η β-θαλασσαιμία είναι μια σοβαρή χρόνια αιμοσφαιρινοπάθεια η οποία χωρίς έγκαιρη έναρξη υποστηρικτικής αγωγής οδηγεί στον θάνατο στην πρώτη παιδική ηλικία. Η μεταμόσχευση μυελού των οστών αποτελεί μία αποτελεσματική ριζική θεραπεία της νόσου αλλά συνοδεύεται από σοβαρές επιπλοκές, όπως η απόρριψη του μοσχεύματος και η νόσος του μοσχεύματος έναντι του ξενιστή, ενώ επιπλέον είναι διαθέσιμη μόνο για ένα μικρό ποσοστό των ασθενών (10%) που έχουν συμβατό δότη. Η πλειοψηφία των ασθενών εξαρτάται από τακτικές μεταγγίσεις αίματος και υποστηρικτική φαρμακευτική αγωγή που τα τελευταία χρόνια οδήγησε σε σημαντική αύξηση της διάρκειας ζωής τους. Η θεραπεία όμως αυτή είναι επίπονη, έχει πολλές παρενέργειες με αποτέλεσμα τη χαμηλή ποιότητα ζωής των ασθενών, ενώ επιπλέον έχει και πολύ υψηλό κόστος. Ως εκ τούτου, η ανάπτυξη μίας ριζικής και καθολικής θεραπείας έχει αποτελέσει αντικείμενο εντατικών ερευνητικών προσπαθειών τις τελευταίες δεκαετίες.
Στον τομέα της γονιδιακής θεραπείας, οι ερευνητικές προσπάθειες των δύο τελευταίων δεκαετιών οδήγησαν στην ανάπτυξη σχετικά αποτελεσματικών θεραπευτικών εργαλείων που βασίζονται στην προσθήκη ενός φυσιολογικού γονιδίου της β-σφαιρίνης στα βλαστικά κύτταρα του ασθενούς. Επί του παρόντος, η πλειοψηφία των τρεχουσών κλινικών δοκιμών για γονιδιακή θεραπεία της β-θαλασσαιμίας βασίζεται στην πιο πάνω προσέγγιση, η οποία αποφεύγει τις ανοσολογικές επιπλοκές της ετερόλογης μεταμόσχευσης εφόσον χρησιμοποιεί τα κύτταρα του ίδιου του ασθενούς, αλλά λόγω τεχνικών περιορισμών δε φαίνεται προς το παρόν να επιτυγχάνει την πλήρη θεραπεία των πιο σοβαρών μορφών της νόσου. Τέτοια σοβαρή μορφή β-θαλασσαιμίας είναι και αυτή που προκαλείται από την πιο συχνή για τον κυπριακό πληθυσμό μετάλλαξη IVSI-110. Συγκεκριμένα, η μετάλλαξη IVSI-110 συναντάται στο 9% του γενικού πληθυσμού και στο 90% των ασθενών με β-θαλασσαιμία στην Κύπρο, ενώ είναι επίσης συχνή και σε πολλές άλλες χώρες.
Στόχος της ερευνητικής ομάδας του Τμήματος Μοριακής Γενετικής Θαλασσαιμίας (ΤΜΓΘ) (Σχημα 1) είναι η ανάπτυξη νέων στοχευμένων γονιδιακών προσεγγίσεων για τη θεραπεία της β-θαλασσαιμίας, μέσω επεξεργασίας του γονιδιώματος, χρησιμοποιώντας τελευταίας τεχνολογίας μοριακά εργαλεία. Συγκεκριμένα, οι ερευνητές του ΤΜΓΘ στοχεύουν στη διόρθωση του λανθασμένου ματίσματος που προκαλείται από την IVSI-110 μετάλλαξη, χρησιμοποιώντας τεχνητές νουκλεάσες, όπως CRISPR/Cas9 και TALENs, οι οποίες καταστρέφουν τα μη-φυσιολογικά ρυθμιστικά στοιχεία ματίσματος σε επίπεδο DNA. Συνοπτικά, οι νουκλεάσες σχεδιάστηκαν κατάλληλα ώστε να προσδένονται και να κόβουν τη διπλή έλικα του DNA κοντά ή ακριβώς στο σημείο της μετάλλαξης, ενεργοποιώντας τον συχνό και πολύ αποτελεσματικό κυτταρικό επιδιορθωτικό μηχανισμό της μη-ομόλογης σύνδεσης άκρων (non-homologous end joining, NHEJ). Το NHEJ διορθώνει το κόψιμο της διπλής έλικας του DNA με μη πιστό τρόπο, οδηγώντας στην προσθήκη ή απώλεια βάσεων γύρω από την περιοχή της μετάλλαξης, παρέχοντας έτσι δυνατότητα επαναφοράς του φυσιολογικού ματίσματος του pre-mRNA της β-σφαιρίνης και της αποκατάστασης φυσιολογικών επιπέδων β-σφαιρίνης.
H αποτελεσματικότητα και ασφάλεια αυτής της νέας θεραπευτικής προσέγγισης ελέγχθηκε σε αιμοποιητικά προγονικά και βλαστικά κύτταρα ομόζυγων της IVSI-110 μετάλλαξης ασθενών, και τα αποτελέσματα της συγκεκριμένης έρευνας δημοσιεύθηκαν πρόσφατα στο επιστημονικό περιοδικό Haematologica. Συμπερασματικά, και οι δύο τύποι νουκλεασών, CRISPR/Cas9 και TALENs, έδειξαν ψηλή αποτελεσματικότητα πετυχαίνοντας μέχρι ~95% στοχευμένη τροποποίηση στο επίπεδο του γονιδιωματικού DNA στα κύτταρα ασθενών. Επιπλέον, οι ερευνητές του ΤΜΓΘ έδειξαν ότι αυτή η τροποποίηση οδηγεί σε λειτουργική διόρθωση του μεταλλαγμένου γονιδίου και σε επίπεδο mRNA, σύνθεσης αλυσίδων β-σφαιρίνης, και διαφοροποίησης των ερυθροκυττάρων. Είναι αξιοσημείωτο ότι η διόρθωση αυτή των βασικών παραμέτρων της νόσου βασίζεται σε συγκεκριμένες συνθήκες και σχεδιασμούς που ελαχιστοποιούν την ανεπιθύμητη τροποποίηση του παράλογου γονιδίου της δέλτα σφαιρίνης, HBD. Επιπλέον, ο συγκεκριμένος αποτελεσματικός τρόπος διόρθωσης αποφεύγει τον εμπλουτισμό διορθωμένων κυττάρων και την εισαγωγή ξένου DNA και ιικών αλληλουχιών, καθιστώντας έτσι την προσέγγιση ασφαλέστερη και άρα κατάλληλη για κλινική εφαρμογή. 
Επιπλέον, η ίδια προσέγγιση δεν περιορίζεται μόνο στην IVSI-110 μετάλλαξη ή μόνο σε μεταλλάξεις που αφορούν τη β-θαλασσαιμία, αλλά μπορεί επίσης να εφαρμοσθεί για τη διόρθωση παθολογικών μεταλλάξεων σε περισσότερα από 180 διαφορετικά γονίδια. Το ΤΜΓΘ του ΙΝΓΚ εξασφάλισε πρόσφατα χρηματοδότηση από το Ίδρυμα Προώθησης Έρευνας Κύπρου για την περαιτέρω βελτίωση της θεραπευτικής μεθόδου.

Στη φωτογραφία η ομάδα Γονιδιακής Θεραπείας και Τροποποίησης του Γονιδιώματος που πραγματοποίησε την έρευνα. Από αριστερά: Carsten W. Lederer, επικεφαλής της ομάδας Γονιδιακής Θεραπείας και Τροποποίησης Γονιδιώματος, Μαρίνα Κλεάνθους, Διευθύντρια του Τμήματος Μοριακής Γενετικής Θαλασσαιμίας, Παναγιώτα Παπασάββα, Κοραλία Στεφάνου και Πέτρος Πατσαλή, κύριος ερευνητής της μελέτης.

Σχεδιάγραμμα της ανάλυσης της θεραπευτικής προσέγγισης σε κύτταρα ασθενών μετά από επεξεργασία του γονιδιώματος με TALENs και CRISPR/Cas9. A) Στατιστικά σημαντική βελτίωση του ποσοστού τροποποιημένων κυττάρων που βρίσκονται σε τελικό στάδιο ερυθροποίησης συγκριτικά με τα μη-τροποποιημένα κύτταρα (GFP & UT). Β) Διόρθωση του ματίσματος του HBB pre-mRNA (ποσοστό φυσιολογικού και ελλαττωματικού HBB mRNA), Γ) ποσοστιαία αναλογία του συνόλου των αλυσίδων β-like σφαιρινών και Δ) επίπεδα σύνθεσης αλυσίδων β-σφαιρίνης συγκριτικά με τα φυσιολογικά επίπεδα σε κύτταρα υγιών ατόμων.