Molecular Genetics, Function & Therapy Department

ΕΡΕΥΝΑ

Νέα μέθοδος θεραπείας εναντίον μυικών δυστροφιών

RNA απταμερή, ένα νέο εργαλείο για την στοχοθετημένη παράδοση θεραπευτικών μορίων στον σκελετικό μυ.

Οι μυϊκές δυστροφίες είναι μια μεγάλη ομάδα κληρονομικών ασθενειών οι οποίες χαρακτηρίζονται από προοδευτική μυϊκή αδυναμία και εκφυλισμό του κινητικού συστήματος. Αν και υπάρχουν αρκετές ελπιδοφόρες πειραματικές στρατηγικές, προς το παρόν, οι μόνες θεραπείες περιλαμβάνουν κλινική αντιμετώπιση των συμπτωμάτων. Μία πολλά υποσχόμενη θεραπευτική προσέγγιση είναι η γονιδιακή θεραπεία με τη χρήση ολιγονουκλεοτιδίων. Ωστόσο, η πλειοψηφία των ολιγονουκλεοτιδίων που χορηγούνται συστηματικά δεν απορροφώνται αποτελεσματικά από  τους σχετικούς μυείς, οδηγώντας έτσι σε χαμηλή θεραπευτική ανταπόκριση. Επομένως, η εύρεση στρατηγικών που θα μπορούσαν να αυξήσουν την πρόσληψη αυτών των θεραπευτικών μορίων στους μύες θα ήταν ιδιαίτερα σημαντική.

Μια πολλά υποσχόμενη μέθοδος που δεν έχει ακόμη εξερευνηθεί στον τομέα των μυϊκών δυστροφιών είναι τα RNA απταμερή. Τα απταμερή είναι συνθετικά νουκλεϊκά οξέα μικρού μεγέθους τα οποία παράγονται με την μέθοδο SELEX και χαρακτηρίζονται από εξαιρετικά υψηλές συγγένειες πρόσδεσης με πρωτεΐνες, RNAs, κύτταρα και ιστούς. O μακροπρόθεσμος μας στόχος είναι η εύρεση απταμερών τα οποία να εισάγονται σε όλους τους μύες που επηρεάζονται από μυϊκή δυστροφία κάνοντας έτσι την ολιγονουκλεοτιδική θεραπεία πιο αποτελεσματική. Επομένως, σκοπός αυτής της μελέτης, ήταν να διερευνήσουμε αρχικά κατά πόσο είναι εφικτή η εύρεση απταμερών που στοχεύουν σκελετικούς μύες. 

Η παρούσα μελέτη, η οποία πραγματοποιήθηκε στα πλαίσια διδακτορικού προγράμματος, στο τμήμα Μοριακής Γενετικής Λειτουργίας και Θεραπείας του Ινστιτούτου Νευρολογίας και Γενετικής Κύπρου, περιγράφει την απομόνωση και τον αρχικό χαρακτηρισμό ενός RNA απταμερούς (Α01Β) το οποίο εισέρχεται αποτελεσματικά στον σκελετικό μυ τόσο in vitro όσο και in vivo. Αυτό το απταμερές εξελίχθηκε μέσα από χιλιάδες τυχαίους συνδυασμούς ολιγονουκλεοτιδίων μέσω επαναληπτικών γύρων εμπλουτισμού (ευρέως γνωστό ως in vitro SELEX) στην αντιπροσωπευτική μυϊκή κυτταρική σειρά C2C12 myoblasts. Κατά την διάρκεια αυτών των επαναληπτικών γύρων εμπλουτισμού, το Α01Β RNA απταμερές ήταν το επικρατέστερο. Το Α01Β απταμερές κατά προτίμηση εισχωρεί στα C2C12 κύτταρα και παρουσιάζει μειωμένη αναγνώριση άλλων μη στοχευμένων κυτταρικών σειρών, όπως είναι τα ηπατικά, τα νεφρικά και τα μακροφάγα κύτταρα (εικόνα 1Γ). Επιπλέον, το Α01Β RNA απταμερές διατηρεί τη λειτουργικότητά του ακόμα και μετά από ενδομυϊκή χορήγηση σε ποντίκια, υποδεικνύοντας με αυτό τον τρόπο μια νέα πιθανή προσέγγιση για τη στόχευση σκελετικών μυών (εικόνα 1Α,Β). 

Η παρούσα μελέτη γνωστοποιεί το πρώτο παράδειγμα απομόνωσης ενός απταμερούς που μπορεί να εισχωρήσει σε κύτταρα των σκελετικών μυών. Μακροπρόθεσμα, τα αποτελέσματα αυτού του έργο αναμένεται να συμβάλουν σημαντικά στην ανάπτυξη πιο στοχευμένων ολιγονουκλεοτιδικών θεραπειών ενάντια στις μυϊκές δυστροφίες.

 
Εικόνα 1: Η επιλεκτική αναγνώριση του σκελετικού μυός από το A01B RNA απταμερές. (Α) Αντιπροσωπευτικές εικόνες διατομών του πρόσθιου μυ της κνήμης από ποντίκια που εγχύθηκαν με φθορίζον Α01Β RNA απταμερές (κόκκινο), scramble A01B (κόκκινο) ή PBS (κλίμακα, 150 mm). Εικόνες (δεξιά στήλη) μεγαλύτερης μεγέθυνσης  λήφθηκαν για τις περιοχές που υποδεικνύονται με λευκά τετράγωνα (κλίμακα, 75 mm). Οι πυρήνες των κυττάρων εμφανίζονται μπλε.(Β) Ποσοτικοποίηση των επιπέδων του A01B RNA απταμερούς και scramble A01B στο σκελετικό μυ μετά από τοπική χορήγηση. Τα δεδομένα παρουσιάζονται σαν μέση τιμή ± τυπική απόκλιση (*p <0,05, Student’s t-test. n=3). (Γ) Ποσοτικοποίηση των επιπέδων του A01B RNA απταμερούς σε διάφορες κυτταρικές σειρές χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής. Τα δεδομένα παρουσιάζονται σαν μέση τιμή ± τυπική απόκλιση (*p <0,05, One way Anova with Dunnett's multiple comparisons test, n=3).  

Στυλιάνα Φιλίππου
Μεταδιδακτορική Ερευνήτρια
Τμήμα Μοριακής Γενετικής, Λειτουργίας & Θεραπείας