Cytogenetics and Genomics Department

YΠΗΡΕΣΙΕΣ, Διάγνωση σύνθετων χρωμοσωμικών ανωμαλιών

Συνδυασμός κλασσικής χρωμοσωμικής  ανάλυσης και τεχνολογιών αιχμής για τον ακριβή προσδιορισμό πολύπλοκων χρωμοσωμικών ανωμαλιών
 
 
Εισαγωγή
Η παρουσίαση της παρούσας εργασίας που αφορούσε την περιγραφή περιστατικών που κλήθηκαν να εξεταστούν από το Τμήμα Κυτταρογενετικής και Γονιδιωματικής του Ινστιτούτου Νευρολογίας και Γενετικής Κύπρου και τα οποία παρουσίαζαν ιδιαίτερο ενδιαφέρον ως προς την πολυπλοκότητά τους, έλαβε το πρώτο βραβείο του εκπαιδευτικού προγράμματος Clinical Genomics and NGS ανάμεσα σε ένα άκρως ανταγωνιστικό επιστημονικό περιβάλλον.  
Το εκπαιδευτικό πρόγραμμα Clinical Genomics and NGS έλαβε χώρα στο Μπερτινόρο Ιταλίας από τις 28 Απριλίου μέχρι τις 3 Μαΐου 2019. Το πρόγραμμα αυτό συνδιοργανώθηκε από τα European Society of Human Genetics (ESHG), European School of Genetic Medicine (ESGM) και University Residential Centre of Bertinoro (Ce.U.B). Οι διαλέξεις απευθύνονταν σε επιστήμονες που εργάζονται σε κλινικά διαγνωστικά εργαστήρια και αφορούσαν μεταξύ άλλων τη μέθοδο Αλληλούχισης Νέας Γενιάς [Next Generation Sequencing (NGS)] και το πως αυτή μπορεί να χρησιμοποιηθεί στην κλινική γενετική διάγνωση.
Στόχος των διαλέξεων αυτών ήταν η ενημέρωση και  εξοικείωση των επιστημόνων με την τεχνολογία αυτή, η οποία είναι καθοριστικής σημασίας για τη διάγνωση ασθενών με σπάνιες και όχι μόνο παθήσεις, η πλειοψηφία των οποίων παραμένουν μέχρι σήμερα αδιάγνωστοι.  Επιπλέον, μέσα από μια σειρά εργαστηρίων, οι ερευνητές είχαν την ευκαιρία να μελετήσουν πραγματικά κλινικά περιστατικά, η πολυπλοκότητα των οποίων υπογραμμίζει την ανάγκη εισαγωγής και χρήσης των τεχνολογιών αιχμής στα κλινικά εργαστήρια.  Μέρος της δουλειάς αυτής περιγράφεται πιο κάτω.
 
Παρουσίαση περιστατικών
Τα τελευταία χρόνια με την εισαγωγή γονιδιωματικών τεχνικών υψηλής απόδοσης και ευκρίνειας στα κλινικά εργαστήρια, η διαγνωστική  ικανότητα έχει αυξηθεί σημαντικά. Συγκεκριμένα, η εφαρμογή  του Γενωμικού Συγκριτικού Υβριδισμού με Μικροσυστοιχίες DNA (array-CGH) και το NGS έχουν περιορίσει σε μεγάλο βαθμό τις κλασσικές μεθόδους κυτταρογενετικής ανάλυσης, όπως για παράδειγμα τη χρωμοσωμική ανάλυση. Οι σύγχρονες αυτές τεχνικές παρέχουν τη δυνατότητα ανίχνευσης μικρών χρωμοσωμικών αναδιατάξεων (μικροδιπλασιασμών/μικροελλειμμάτων) και αλλαγών σε επίπεδο μέχρι και ενός νουκλεοτιδίου στο DNA, η ανίχνευση των οποίων ήταν πολύ χρονοβόρα ή και ανέφικτη μέχρι πριν από μερικά χρόνια, με τις κλασσικές μοριακές μεθόδους. Σήμερα, οι τεχνικές αυτές αποτελούν τη πρώτη επιλογή μοριακών διαγνωστικών εξετάσεων σε ασθενείς με νοητική στέρηση, διαταραχές φάσματος του αυτισμού και συγγενείς ανωμαλίες [1]. Παρά το γεγονός ότι και οι δύο αυτές τεχνικές αποτελούν σημαντικές προόδους στη γενετική διάγνωση, η κλασσική χρωμοσωμική ανάλυση εξακολουθεί να είναι απαραίτητη σε πολλές περιπτώσεις για να ξεπεραστούν οι περιορισμοί των μεθόδων αυτών και ιδιαίτερα για τον προσδιορισμό της κληρονομικότητας και του  ρίσκου  στους απογόνους. Σκοπός αυτού του άρθρου είναι η περιγραφή τεσσάρων ασθενών με σύνθετες χρωμοσωμικές ανωμαλίες όπου ο συνδυασμός των τεχνολογιών αιχμής  μαζί με τη κλασσική χρωμοσωμική ανάλυση έδωσαν ακριβή διάγνωση. 
 
Ασθενής 1
45,X/46,XX,r(18)(p11.32q23)dn/46,XX.arr(X)x1[0.2]
 
Αμνιακό υγρό από κύηση 2ου τριμήνου, παραπέμφθηκε στο Τμήμα Κυτταρογενετικής και Γονιδιωματικής για χρωμοσωμική ανάλυση, Ποσοτική-Φθορίζουσα Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης (QF-PCR) και array-CGH λόγω αυξημένης αυχενικής διαφάνειας (4.1mm). Τα αποτελέσματα από τις μοριακές αναλύσεις ήταν ενδεικτικά για μωσαϊκή μονοσωμία του χρωμοσώματος Χ στο ~20% των κυττάρων του εμβρύου (εικ.1γ). Ακολούθως, η χρωμοσωμική ανάλυση, σε αντίθεση με τις μοριακές εξετάσεις, ήταν ενδεικτική για τρεις κυτταρικές σειρές. Από τις 100 μεταφάσεις που αναλύθηκαν, το 58% είχαν φυσιολογικό θηλυκό καρυότυπο (46,ΧΧ), το 20% είχαν ένα δακτυλιοειδές χρωμόσωμα 18 (ring chromosome) (εικ.1α) και το 20% είχαν μονοσωμία του χρωμοσώματος Χ. Συνήθως, το δακτυλιοειδές χρωμόσωμα δημιουργείται από ελλείψεις γενετικού υλικού από τα δύο άκρα του χρωμοσώματος, το οποίο σταθεροποιείται με την συγκόλληση των δύο άκρων δημιουργώντας το δακτυλιοειδές σχήμα. Σε αυτή την περίπτωση, υπήρχε ένα πλήρες δακτυλιοειδές χρωμόσωμα 18 εξού και δεν ανιχνεύθηκαν ελλείψεις στα άκρα του χρωμοσώματος αυτού ούτε με την μέθοδο array-CGH αλλά ούτε και με την τεχνική φθορίζουσας in situ υβριδισμού  (FISH) (εικ.1β). Η πρόγνωση της συγκεκριμένης προγεννητικής διάγνωσης διαφοροποιήθηκε λόγω της χρωμοσωμικής εξέτασης. Επιπλέον, οι καρυότυποι από τους γονείς ήταν φυσιολογικοί υποδηλώνοντας χαμηλό ρίσκο για επανάληψη του συμβάντος σε μελλοντικές εγκυμοσύνες. 
 
Ασθενής 2
46,XX,r(20)(p13q13.33)/46,XX,dic r(20)(p13q13.33)/46,XX.arr(1-22,X)x2
 
Περιφερικό αίμα από ενήλική γυναίκα παραπέμφθηκε στο Τμήμα Κυτταρογενετικής και Γονιδιωματικής λόγω πνευματικής καθυστέρησης, μακροκεφαλίας και επιληψίας. Ως πρώτη διαγνωστική ανάλυση χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος array-CGH όπου και έδωσε φυσιολογικά αποτελέσματα  (εικ.2γ). Η χρωμοσωμική ανάλυση της ασθενούς, έδειξε τρεις κυτταρικές σειρές. Από τις 100 μεταφάσεις που αναλύθηκαν, το 18% είχαν φυσιολογικό θηλυκό προφίλ, (46,ΧΧ), το 79% είχαν ένα δακτυλιοειδές χρωμόσωμα 20 (εικ.2α) και το 3% είχαν ένα μεγαλύτερο δικεντρικό δακτυλιοειδές χρωμόσωμα 20. Στα δακτυλιοειδή χρωμοσώματα που βρέθηκαν δεν εντοπίστηκαν ελλείμματα στα τελομερή του χρωμοσώματος 20 όπως φάνηκε από τις μοριακές εξετάσεις (εικ.2β). Τέλος, σε αυτό το περιστατικό, η καρυοτυπική ανάλυση ήταν βαρύνουσας σημασίας καθώς η κλινική εικόνα του ασθενή σχετίζεται με τα εργαστηριακά ευρήματα.
 
Ασθενής 3
46,XY,der(14)t(14;17)(p11.2;q25.1)pat.arr 17q25.1q25.3(73608244_81044553)x3 pat
 
Δείγμα χοριακών λαχνών από κύηση 1ου τριμήνου παραπέμφθηκε στο Τμήμα Κυτταρογενετικής και Γονιδιωματικής λόγω αυξημένης αυχενικής διαφάνειας (10mm).  Για το περιστατικό αυτό ζητήθηκε χρωμοσωμική ανάλυση, QF-PCR και array-CGH. Η ανάλυση QF-PCR έδειξε φυσιολογικά αποτελέσματα για τα χρωμοσώματα 13, 18, 21, Χ και Υ, ενώ το array-CGH ήταν ενδεικτικό για διπλασιασμό ~7.5Mb στο μεγάλο βραχίονα του χρωμοσώματος 17 (εικ.3δ). Η χρωμοσωμική ανάλυση του εμβρύου έδειξε φυσιολογικά αποτελέσματα καθώς η διακριτική ικανότητα του κλασσικού καρυότυπου είναι 5-10Μb (εικ.3α). Ακολούθως, η χρωμοσωμική ανάλυση των γονέων έδειξε ότι ο πατέρας είναι φορέας μιας ισοζυγισμένης μετάθεσης (balanced reciprocal translocation) μεταξύ του μικρού βραχίονα του χρωμοσώματος 14 (δορυφόροι) και του μεγάλου βραχίονα του χρωμοσώματος 17 στις ακριβείς περιοχές 14p11.2 και 17q25.1 αντίστοιχα. (εικ.3β) και ότι το έμβρυο κληρονόμησε μόνο το παράγωγο χρωμόσωμα 14 (derivative) (εικ.3γ). Να σημειωθεί ότι η κάλυψη της δορυφορικής περιοχής του χρωμοσώματος 14 δεν είναι δυνατή με τη μέθοδο του array-CGH. Παρά το γεγονός ότι ο καρυότυπος έδειξε φυσιολογικά αποτελέσματα στο έμβρυο, οι χρωμοσωμικές εξετάσεις των γονέων  βοήθησαν στη σωστή  αξιολόγηση του ρίσκου κληρονομικότητας, το οποίο είναι  υψηλό,  σε μεταγενέστερες εγκυμοσύνες για το εν λόγω ζευγάρι.
 
Ασθενής 4
46,XX,t(2;3)(q22;q13.2)dn,inv(8)(p23.1q24.1)dn.arr 8q24.11(118813668_118816960)x1 dn
 
Περιφερικό αίμα από γυναίκα νεαρής ηλικίας παραπέμφθηκε στο Τμήμα Κυτταρογενετικής και Γονιδιωματικής με κλινική διάγνωση τις κληρονομικές πολλαπλές εξοστώσεις [(hereditary multiple exostoses, OMIM#133700)]. Πρόκειται για ένα αυτοσωμικό επικρατές νόσημα που χαρακτηρίζεται από τη δημιουργία πολλαπλών οστεοχονδρομάτων στο σκελετό του ασθενούς. Το νόσημα αυτό προκαλείται κυρίως από μεταλλάξεις στα γονίδια EXT1 και EXT2 [2]. Η χρωμοσωμική ανάλυση της ασθενούς έδειξε δύο αναδιατάξεις: μια ισοζυγισμένη μετάθεση μεταξύ του μεγάλου βραχίονα του χρωμοσώματος 2 και του μεγάλου βραχίονα του χρωμοσώματος 3 στις ακριβείς θέσεις 2q22 και 3q13.2 αντίστοιχα και μια περικεντρική αναστροφή στο χρωμοσώματος 8 στη χρωμοσωμική περιοχή 8p23.1q24.1 (εικ.4α). Το προφίλ του array-CGH ήταν ενδεικτικό μιας καινούργιας ετεροζυγωτικής έλλειψης μεγέθους 3.1kb στην περιοχή 8q24.11 (εικ.4γ). Λόγω  του μικρού μεγέθους, η έλλειψη επιβεβαιώθηκε με τη μέθοδο αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης πραγματικού χρόνου (qRT-PCR) με ειδικά σχεδιασμένους εκκινητές για την περιοχή του ενδιαφέροντος (εικ.4β). Η περιοχή αυτή εντοπίζεται στο γονίδιο EXT1 (OMIM#608177) και προκαλεί στη διαγραφή των εξωνίων 10 και 11. Η αναστροφή που ανιχνεύτηκε με τη χρωμοσωμική εξέταση μαζί με το μικροέλλειμμα προκαλούν τη δημιουργία μιας ημιτελούς πρωτεΐνης που ευθύνεται για το φαινότυπο της ασθενούς. 
 
 
Επί του παρόντος, η πρώτη επιλογή μοριακών διαγνωστικών εξετάσεων σε ασθενείς με νοητική στέρηση,  αναπτυξιακή καθυστέρηση και συγγενείς ανωμαλίες είναι η μέθοδος array-CGH. Τα τελευταία χρόνια η μέθοδος αυτή εφαρμόζεται και στον προγεννητικό έλεγχο. Συγκριτικά με την κλασσική καρυοτυπική ανάλυση, τα οφέλη της μεθόδου array-CGH υπερισχύουν τόσο στην ευκρίνεια όσο και στο χρόνο που απαιτείται για την εύρεση διάγνωσης. Επίσης, η υψηλότερη διαγνωστική ικανότητα  που προσφέρει η τεχνική αυτή έχει ανοίξει νέους ορίζοντες στη γενετική διάγνωση και πολλοί ασθενείς επωφελούνται από αυτή. Από την άλλη, η κλασσική καρυοτυπική ανάλυση είναι ακόμα αναγκαία και πολύ σημαντική για να παρέχει μια ολοκληρωμένη γενετική διάγνωση σε πολύπλοκα περιστατικά και σε περιπτώσεις όπου η παραπομπή αφορά συγκεκριμένες κατηγορίες ασθενών όπως για παράδειγμα φορέων ισοζυγισμένων αναδιατάξεων. Ο συνδυασμός των υφιστάμενων μοριακών διαγνωστικών εξετάσεων και της κλασσικής χρωμοσωμικής εξέτασης παρέχει τη δυνατότητα ακριβούς διάγνωσης σε ασθενείς με πολύπλοκες χρωμοσωμικές ανωμαλίες. Τέλος, η ραγδαία ανάπτυξη της τεχνολογίας δεν θα μπορούσε να αφήσει ανεπηρέαστο τον τομέα της γενετικής διάγνωσης. Ένα παράδειγμα αυτής της ανάπτυξης είναι η μέθοδος NGS, η οποία παρέχει  τη δυνατότητα αλληλούχισης ολόκληρου του γονιδιώματος σε σύντομο χρονικό διάστημα με αποτέλεσμα την ακόμη πιο υψηλή ευκρίνειας ανάλυσης για εξαγωγή χρήσιμων πληροφοριών για το γενετικό προφίλ του ασθενούς και την πιθανή εξατομικευμένη θεραπεία. Αναμφίβολα η γενετική διάγνωση βαδίζει με πολύ γρήγορους ρυθμούς προς την εποχή των «omics» και ο συνδυασμός των μεθόδων array-CGH και NGS αποτελούν τα κύρια διαγνωστικά εργαλεία για πολλούς ασθενείς. Ωστόσο ο ρόλος της κλασσικής χρωμοσωμικής ανάλυσης είναι μείζονος σημασίας για τον προσδιορισμό του ρίσκου επανεμφάνισης μιας χρωμοσωμικής ανωμαλίας και για την ακριβή γενετική διάγνωση των ασθενών.
 
Παναγιώτης Μυριανθόπουλος
Εργαστηριακός Επιστημονικός Λειτουργός 2
Τμήμα Κυτταρογενετικής και Γονιδιωματικής
 
 
Βιβλιογραφία
  1. Miller DT, Adam MP, Aradhya S, Biesecker LG, Brothman AR, Carter NP, et al. Consensus Statement: Chromosomal Microarray Is a First-Tier Clinical Diagnostic Test for Individuals with Developmental Disabilities or Congenital Anomalies. Am J Hum Genet. Cell Press; 2010;86: 749–764. doi:10.1016/J.AJHG.2010.04.006
  2. Tanteles GA, Nicolaou M, Neocleous V, Shammas C, Loizidou MA, Alexandrou A, et al. Genetic screening of EXT1 and EXT2 in Cypriot families with hereditary multiple osteochondromas. J Genet. 2015;94: 749–54. Available: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26690531
Related Articles
winner