Cytogenetics and Genomics Department

Όνομα συντάκτη: Δρ Λουτμίλα Κουσουλίδου
Επιστημονικός συνεργάτης, 
Τμήμα Κυτταρογενετικής και Γονιδιωματικής ΙΝΓΚ
Διευθύντρια Τμήματος: Δρ. Καρολίνα Σισμάνη
Τηλ.: 22392829

Μια τεχνολογία ανάλυσης γενετικού υλικού που χρησιμοποιείται εδώ και χρόνια στο ΙΝΓΚ για ερευνητικούς σκοπούς,  έχει ήδη ενταχθεί  και στις υπηρεσίες γενετικής διάγνωσης του Τμήματος Κυτταρογενετικής και Γονιδιωματικής. Η νέα αυτή μέθοδος ονομάζεται «αλληλούχιση DNA νέας γενιάς» ή “next-generation sequencing” (NGS)  και προσφέρει αυξημένη ευκρίνεια και αποτελεσματικότητα στον εντοπισμό γενετικών λαθών, αναβαθμίζοντας σημαντικά την ποιότητα των διαγνωστικών υπηρεσιών. 

Η σημασία της γενετικής διερεύνησης για την έγκυρη διάγνωση και θεραπεία 
Όλες οι πληροφορίες που χρειάζονται για τη λειτουργία του ανθρώπινου οργανισμού είναι καταγεγραμμένες σε 46 χρωμοσώματα. Λάθη που προκύπτουν στον αριθμό των χρωμοσωμάτων ή στην ακεραιότητα και σύσταση του γενετικού υλικού που εμπεριέχεται στα χρωμοσώματα, μπορούν να προκαλέσουν γενετικές παθήσεις ή σύνδρομα, όπως νοητική στέρηση, αναπτυξιακές διαταραχές, συγγενείς ανωμαλίες, νευρολογικές παθήσεις κ.ά. 
Συνεπώς, η γενετική διερεύνηση αποτελεί αναπόσπαστο μέρος της διάγνωσης γενετικών ασθενειών και συνδρόμων, τόσο σε προγεννητικό όσο και σε μεταγεννητικό στάδιο. Ο ακριβής εντοπισμός του γενετικού λάθους και κατά συνέπεια η ταυτοποίηση του γενετικού συνδρόμου από το οποίο πάσχει ο κάθε ασθενής, μπορεί βοηθήσει στην πρόβλεψη των συμπτωμάτων που πιθανόν να αναπτυχθούν στο μέλλον, του τρόπου κληρονόμησης και του κινδύνου μετάδοσης της ασθένειας από γενιά σε γενιά, καθώς και να βοηθήσει στη διαχείριση και θεραπεία των ασθενών. Έτσι θα μπορούν οι ίδιοι οι πάσχοντες αλλά και οι οικογένειές τους, να λάβουν εξατομικευμένη συμβουλευτική αγωγή και άλλες γενετικές υπηρεσίες, βελτιώνοντας σημαντικά την ποιότητα ζωής τους. 

Υφιστάμενες διαδικασίες γενετικής διάγνωσης 
Αυτή τη στιγμή στο Τμήμα Κυτταρογενετικής και Γονιδιωματικής διεξάγονται γενετικές διαγνώσεις με τη χρήση μιας σειράς από μεθόδους. Η χρωμοσωμική ανάλυση, ή αλλιώς «καρυότυπος» περιλαμβάνει μικροσκοπική εξέταση χρωμοσωμάτων και ανίχνευση ανευπλοιδιών, δηλαδή αλλαγών στον αριθμό των χρωμοσωμάτων στα ανθρώπινα κύτταρα, καθώς και δομικών ανωμαλιών όπως μεγάλης έκτασης (άνω των 5 μεγαβάσεων) ελλείμματα, αναδιπλασιασμούς και μετατοπίσεις γενετικού υλικού. Έτσι εντοπίζονται εύκολα γνωστά σύνδρομα, όπως το σύνδρομο Down που προκαλείται από τρισωμία (δηλαδή ένα επιπλέον αντίγραφο) του χρωμοσώματος 21. 
Μικρότερης έκτασης γενετικές ανωμαλίες που δεν μπορούν να ανιχνευθούν με καρυότυπο, ανιχνεύονται με τη μέθοδο συγκριτικού γονιδιωματικού υβριδισμού σε μικροσυστοιχίες ονομαζόμενη «array-CGH» (γνωστή και ως «μοριακός κατυότυπος) που βασίζεται σε απομόνωση DNA και σάρωση του γονιδιώματος για ανεύρεση μικροελλειμμάτων και μικροαναδιπλασιαμών. 
Σε περιπτώσεις όπου υπάρχει υποψία για συγκεκριμένο σύνδρομο, εφαρμόζονται μέθοδοι που αντί να σαρώνουν ολόκληρο το γονιδίωμα ψάχνοντας γενετικά λάθη, επικεντρώνονται σε μία συγκεκριμένη περιοχή που θεωρείται υπεύθυνη για το εν λόγω σύνδρομο και στοχεύουν στην ανίχνευση συγκεκριμένου γενετικού λάθους. Στις περιπτώσεις αυτές επιτυγχάνεται πολύ υψηλή ευκρίνεια, ειδικά με τη μέθοδο αλληλούχισης κατά Sanger, όπου μπορεί να εντοπιστούν ακόμα και μεταλλάξεις σε ένα μόνο νουκλεοτίδιο, που είναι ο μικρότερος ανιχνεύσιμος κρίκος της αλυσίδας του DNA.     
Για τις πιο πάνω εξετάσεις παραπέμπονται ασθενείς με ένα ευρύ φάσμα κλινικών συμπτωμάτων, τα οποία ενάγουν υποψίες για γενετική αιτιολογία. Διεξάγονται επίσης προγεννητικές διαγνώσεις, καθώς και γενετική αξιολόγηση εμβρύων κατά τη διαδικασία εξωσωματικής γονιμοποίησης (προεμφυτευτικός έλεγχος ανευπλοειδιών).
Παρά το υψηλό ποσοστό επίτευξης διάγνωσης, ακόμη και μέχρι σήμερα πολλά περιστατικά παραμένουν αδιάγνωστα. Δηλαδή, ενώ στην οικογένεια υπάρχει έντονη ένδειξη γενετικής παθολογίας από κλινικής άποψης, εντούτοις δεν κατέστη δυνατόν να ανιχνευθεί καμία γενετική ανωμαλία με καμία από τις διαθέσιμες μεθόδους. Στις περιπτώσεις αυτές ίσως πρόκειται για μία άγνωστη μετάλλαξη που είναι πέραν της εμβέλειας του καρυότυπου και της array-CGH και εφόσον είναι άγνωστη, δεν μπορεί να γίνει στοχευμένη ανάλυση με αλληλούχιση κατά Sanger.    

Τί είναι η αλληλούχιση DNA νέας γενιάς (Next-Generation Sequencing – NGS) 
Η  αλληλούχιση DNA νέας γενιάς ή αλλιώς NGS, αποτελεί μια εξέλιξη της κλασσικής αλληλούχισης κατά Sanger, όπου γίνεται «ανάγνωση» όλων των νουκλεοτιδίων που αποτελούν την αλυσίδα του μορίου DNA, δίνοντας την δυνατότητα ανεύρεσης πιθανών «λαθών» (μεταλλάξεων) μέσα στην αλυσίδα αυτή. Η σημαντική διαφορά μεταξύ των δύο μεθόδων έγκειται στο ότι, ενώ η αλληλούχιση κατά Sanger στοχεύει σε μία επιλεγμένη περιοχή που μας ενδιαφέρει, «διαβάζοντας» μόνο μέχρι και 1000 νουκλεοτίδια, η NGS μπορεί να «σαρώσει» ταυτόχρονα ολόκληρο το ανθρώπινο γονιδίωμα (whole-genome sequencing – WGS)  ή πολλαπλές επιλεγμένες περιοχές όπως όλα τα εξώνια (κωδικοποιητικά μέρη) γονιδίων (whole-exome sequencing – WES), ή μεγάλες ομάδες γονιδίων που συνδέονται με συγκεκριμένα σύνδρομα (gene panels). Με το τρόπο αυτό επιτυγχάνεται όχι μόνο ύψιστη ευκρίνεια, αλλά και ασύγκριτη απόδοση με γρήγορη ταυτόχρονη επεξεργασία μεγάλου αριθμού δειγμάτων και εξαγωγή μεγάλου όγκου πληροφοριών σε σχετικά χαμηλό κόστος. ’Ετσι, γίνεται πλέον εφικτή η διαλεύκανση περιστατικών που δεν κατέστη δυνατόν να λάβουν διάγνωση με τις υπάρχουσες μεθόδους.  
Στην Εικόνα 1 παρουσιάζεται συνοπτικά η διαδικασία που ακολουθείται κατά την εφαρμογή της NGS, ξεκινώντας  με απομόνωση γενετικού υλικού (DNA) από δείγμα περιφερικού αίματος του ασθενούς. Ακολουθεί κατακερματισμός του DNA για να διευκολυνθεί η αλληλούχιση και ειδικός υβριδισμός με άλλα μόρια DNA που αντιπροσωπεύουν τις περιοχές που μας ενδιαφέρουν. Αυτό γίνεται αν θέλουμε να επικεντρωθούμε μόνο στα εξώνια ή σε συγκεκριμένες ομάδες γονιδίων, ενώ υπάρχει και η δυνατότητα άμεσης αλληλούχισης μετά τον κατακερματισμό σε περίπτωση που θέλουμε να αναλύσουμε ολόκληρο το γονιδίωμα. Στο επόμενο στάδιο τα κομμάτια του κατακερματισμένου DNA «διαβάζονται» ταυτόχρονα και μπαίνουν σε σειρά για να συγκριθούν με την αλληλουχία αναφοράς και να εντοπισθούν πιθανές μεταλλάξεις. Τέλος, οι μεταλλάξεις αξιολογούνται λαμβάνοντας υπόψιν την κλινική εικόνα του ασθενούς έτσι ώστε να διαφανεί κατά πόσο μπορεί να σχετίζονται με την υπό διερεύνηση ασθένεια. 

Εφαρμογή της μεθόδου NGS σε ερευνητικά έργα 
Με την εισαγωγή της NGS στα ερευνητικά κέντρα παγκοσμίως, έχουν εκπονηθεί μελέτες όπου διερευνήθηκαν μεγάλες ομάδες ασθενών με αγνώστου αιτιολογίας γενετικές παθήσεις.   
Το ΙΝΓΚ, συμπεριλαμβανομένου του Τμήματος Κυτταρογενετικής και Γονιδιωματικής, συμμετείχε ενεργά στην παγκόσμια αυτή προσπάθεια, συντονίζοντας ερευνητικά έργα με τη χρήση της NGS. 
Συγκεκριμένα, μέσα από συνεργασία με το Πανεπιστήμιο της Κοπεγχάγης, και στα πλαίσια της διδακτορικής διατριβής της Δρος Κωνσταντίας Αριστείδου,  μελετήθηκαν οικογένειες με πολλαπλές και σύνθετες χρωμοσωμικές μετατοπίσεις οι οποίες όμως δεν δικαιολογούσαν την κλινική τους εικόνα (1, 2). Με τη διεξαγωγή αλληλούχισης ολόκληρου του γονιδιώματος (WGS), αποκαλύφθηκε μια πρόσθετη πολυπλοκότητα στις χρωμοσωμικές τους ανακατατάξεις καθώς και μικρές μεταλλάζεις στα σημεία θραύσης των χρωμοσωμάτων. Προτάθηκαν επίσης νέα γονίδια και μηχανισμοί σε σχέση με την παθολογία που παρουσίαζαν οι ασθενείς. 
Ένα άλλο ερευνητικό έργο εκπονήθηκε στα πλαίσια της διδακτορικής διατριβής της Δρος Ευής Κρητιώτη, όπου εξετάστηκαν 38 αδιάγνωστοι ασθενείς με πολλαπλές συγγενείς ανωμαλίες μαζί με τις οικογένειές τους (συνολικά 103 άτομα), με τη μέθοδο της αλληλούχισης εξωνίων (Whole-exome sequencing – WES) (3). Ως αποτέλεσμα, 17 ασθενείς (ποσοστό 44.7%) έλαβαν γενετική διάγνωση και μάλιστα 11 από τα 18 ευρήματα (61,1%) δεν ήταν γνωστά στη βιβλιογραφία. Επιπλέον, εντοπίστηκε το πρώτο περιστατικό του συνδρόμου Steel στον Ευρωπαϊκό πληθυσμό (4) και αποδόθηκε σε μία νέα μετάλλαξη του γονιδίου COL27A1. 
Βλέποντας τη δυναμική και τα οφέλη της NGS μέσα από την εφαρμογή της στην έρευνα, διαφάνηκε η επιτακτική ανάγκη και το εν δυνάμει όφελός της συμπερίληψής της στις διαγνωστικές υπηρεσίες, αφού ως μεταφραστικό κέντρο, σκοπός των τμημάτων του Ινστιτούτου είναι τα αποτελέσματα των ερευνών τους να χρησιμοποιούνται στην πράξη, μέσα από την παροχή υπηρεσιών.

Εφαρμογή της μεθόδου NGS στη γενετική διάγνωση 
Η ένταξη μιας νέας διαγνωστικής μεθόδου απαιτεί την ανάλογη εξοικείωση από το εργαστηριακό προσωπικό, αλλά και μια αξιολόγηση και προσαρμογή της μεθόδου στις υπάρχουσες συνθήκες. 
Αξιοποιώντας την εμπειρία που αποκτήθηκε κατά την εκπόνηση των πιο πάνω ερευνητικών προγραμμάτων, και κατόπιν ολοκλήρωσης όλων των απαραίτητων διαδικασιών, το Τμήμα Κυτταρογενετικής και Γονιδιωματικής προσφέρει επίσης  τη δυνατότητα και στους Κύπριους ασθενείς να αποκτήσουν πρόσβαση σε αυτή τη νέα τεχνολογία. 
Οι παραλλαγές της NGS που προσφέρονται είναι η αλληλούχιση εξωνίων (Whole-exome sequencing – WES) και εξειδικευμένα «panels» για ασθενείς με χαρακτηριστικά συνδρόμου Rett και Angelman. Προσφέρεται επίσης η παραλλαγή “Clinical exome” όπου συμπεριλαμβάνεται μια πληθώρα γονιδίων που έχουν κριθεί υπεύθυνα ή και ύποπτα για μια σειρά από συχνές αλλά και σπάνιες γενετικές παθήσεις. Οι υπηρεσίες αυτές αποσκοπούν στο να  δώσουν απαντήσεις σε οικογένειες που μετά από ενδελεχή γενετική διερεύνηση δεν έχουν πάρει ακόμη καμία διάγνωση και επιπλέον, θα αποτελέσει εξέταση πρώτης γραμμής για ασθενείς με σπάνια κλινική εικόνα που χρίζουν εις-βάθος διερεύνησης. 

Προκλήσεις και προοπτικές 
Η μέθοδος NGS, παρότι εξαιρετικά αποτελεσματική, εμπεριέχει τις δικές της προκλήσεις όσο αφορά την πρακτική της εφαρμογή, γι’ αυτό και απαιτείται πολύ ψηλό επίπεδο εξειδίκευσης του εργαστηριακού προσωπικού και έγκυρη διαπίστευση του εργαστηρίου που διεξάγει την ανάλυση. 
Η σημαντικά αυξημένη ευκρίνεια έχει ως συνέπεια την ανίχνευση μεγάλου αριθμού «υποψηφίων» μεταλλάξεων, για τις οποίες όμως δεν υπάρχει βιβλιογραφία και η αξιολόγηση και σύνδεσή τους με την κλινική εικόνα του ασθενούς αποτελεί μία από τις κυριότερες προκλήσεις. Επομένως είναι απαραίτητη η εφαρμογή μεθόδων βιοπληροφορικής, όπου υπάρχουν τα προγράμματα και εργαλεία που θα επιτρέψουν την ορθή κατηγοριοποίηση των μεταλλάξεων που ανιχνεύονται. Επίσης, η παραγωγή μεγάλου όγκου δεδομένων καθιστά απαραίτητη τη διαθεσιμότητα ανάλογου επιπέδου ηλεκτρονικών υπολογιστών και τρόπων φύλαξης και επεξεργασίας των δεδομένων αυτών.   
Είναι σημαντικό να αναφερθεί, ότι η ανίχνευση μικροελλειμμάτων και μικροαναδιπλασιασμών με NGS δεν είναι τόσο εύκολη όσο η ανίχνευση σημειακών μεταλλάξεων. Σήμερα υπάρχουν διαθέσιμα εργαλεία βιοπληροφορικής αλλά και τεχνικές παραλλαγές της NGS που επιτρέπουν αυτή την ανάλυση, εντούτοις βρίσκονται σε διαδικασία τελειοποίησης. Επίσης, μεγάλης κλίμακας χρωμοσωμικές μετατοπίσεις χωρίς απώλεια γενετικού υλικού (ισορροπημένες χρωμοσωμικές δομικές αλλαγές), δύσκολα ανιχνεύονται με NGS, συνεπώς η αντικατάσταση όλων των μεθόδων γενετικής διάγνωσης με την NGS δεν είναι άμεσα εφικτή. 
Οι προοπτικές που διαφαίνονται με την παροχή  των υπηρεσιών αυτών από το Τμήμα Κυτταρογενετικής και Γονιδιωματικής, αγγίζουν και τους τρεις πυλώνες του ΙΝΓΚ που είναι οι διαγνωστικές υπηρεσίες, η έρευνα και η εκπαίδευση: η μέθοδος αυτή προσφέρει μια σαφώς αναβαθμισμένη γενετική διερεύνηση σε κάθε ασθενή της Κύπρου κι αυτό  συνεπάγεται με σημαντικά οφέλη για το σύνολο των ασθενών. Το ερευνητικό δυναμικό του ΙΝΓΚ θα ενδυναμωθεί με την ανακάλυψη νέων γονιδίων, περιγραφή νέων παθογόνων μηχανισμών και νέων συνδρόμων. Ταυτόχρονα, η πολύτιμη εμπειρία που θα αποκτηθεί από τους επιστήμονες του ΙΝΓΚ, θα μεταφερθεί άμεσα και στους φοιτητές της Σχολής Μοριακής Ιατρικής και θα προσφέρει τη δυνατότητα εκπόνησης υψηλής ποιότητας πτυχιακών και διδακτορικών εργασιών. 
Τελικός στόχος παραμένει η συνεχής τελειοποίηση, ανάπτυξη και ένταξη νέων τεχνολογιών έτσι ώστε το ΙΝΓΚ να παραμένει ενεργό και καινοτόμο στον τομέα της έρευνας, των υπηρεσιών υγείας και της εκπαίδευσης . 

Βιβλιογραφία

1. Aristidou C, Theodosiou A, Ketoni A, Bak M, Mehrjouy MM, Tommerup N, Sismani C. Cryptic breakpoint identified by whole-genome mate-pair sequencing in a rare paternally inherited complex chromosomal rearrangement. Mol Cytogenet. 2018 Jun 7;11:34. doi: 10.1186/s13039-018-0384-2. PMID: 29930709; PMCID: PMC5991433.
2. Aristidou C, Koufaris C, Theodosiou A, Bak M, Mehrjouy MM, Behjati F, Tanteles G, Christophidou-Anastasiadou V, Tommerup N, Sismani C. Accurate Breakpoint Mapping in Apparently Balanced Translocation Families with Discordant Phenotypes Using Whole Genome Mate-Pair Sequencing. PLoS One. 2017 Jan 10;12(1):e0169935. doi: 10.1371/journal.pone.0169935. Erratum in: PLoS One. 2017 Mar 15;12 (3):e0174190. PMID: 28072833; PMCID: PMC5225008.
3. Kritioti Evie, Theodosiou Athina, Paroaite Thibaud, Alexandrou Angelos, Nicolaou Nayia, Papaevripidou Ioannis, Sejourne Nina, Coste Bertrand, Christophidou-Anastasiadou Violetta, Tanteles A. George and Sismani Carolina. Unravelling the genetic causes of Multiple Malformation Syndromes: A whole exome sequencing study of the Cypriot population. Under revision. 
4. Evie Kritioti, Athina Theodosiou, Nayia Nicolaou, Angelos Alexandrou, Ioannis Papaevripidou, Elisavet Efstathiou, Violetta Christophidou-Anastasiadou, Carolina Sismani, Tanteles GA. First reported case of Steel syndrome in the European population: A novel homozygous mutation in COL27A1 and review of the literature. Eur J Med Genet. 2020 Jul;63(7):103939. doi: 10.1016/j.ejmg.2020.103939. Epub 2020 Apr 30. PMID: 32360765.

Εικόνα 1: Σχηματική περιγραφή της μεθόδου αλληλούχισης DNA νέας γενιάς (NGS)