Research

Title:   Screening and delineation of molecular mechanisms of action of novel agents for the treatment of β-thalassaemia

Funding body: Cyprus Research Promotion Foundation (ΥΓΕΙΑ/ΒΙΟΣ0609(ΒΕ)/01)
Project coordinator: Dr Marina Kleanthous
Partners: Andria Theodrou¹, Dr Marios Phylactides¹, Prof Roberto Cambari², Dr Cristina Zuccato², Dr Ilaria Lamproti², Dr Eleni Katsantoni³, Dr Soteroula Christou⁴, Prof George Stamatoyannopoulos⁵
1. Molecular Thalassaemia Dept, Cyprus Institute of Neurology and Genetics, Cyprus
2. Department of Biochemistry and Molecular Biology, Ferrara University, Italy
3. Biomedical Research Foundation, Academy of Athens, Greece
4. Thalassaemia Centre, Makarios Hospital, Ministry of Health, Cyprus
5. Markey Molecular Medicine Centre, University of Washington, Seattle, USA

Βeta-thalassaemia, an inherited disorder of beta haemoglobin chain production, is a global health burden. Current management is regular blood transfusions with regular iron chelation therapy. However, this is not curative and has substantial morbidity related to iron overload. Mutations that increase foetal haemoglobin (HbF) can meliorate the symptoms of β-thalassaemia and sickle cell disease. Therefore, pharmacological reactivation of γ-globin genes for the production of foetal haemoglobin (HbF) is a very promising therapeutic approach for β-thalassaemia, as foetal haemoglobin can substitute for the absent adult β-haemoglobin. Chemical agents currently used for this purpose have limited application due to moderate therapeutic properties, variable patient response and potential cytotoxic effects. Therefore, identification of novel HbF inducing agents is of critical importance today. Based on literature and preliminary studies at the Host Organization and PA3, five chemical agents with considerable γ-globin reactivation potential have been selected for inclusion in this project. The five compounds,  a) lenalidomide2, b) angelicin3 c) distamycin derivative 1071015 d) 5-aza-2’-deoxycytidine4,5 and e) mithramycin, will be screened ex vivo in human primary erythroid liquid cultures (BFUe) derived from healthy donors to obtain an independent and directly comparable measure of their HbF inducing ability from screening in K562. The two substances with the highest inducing activity and cell survival rates will subsequently be screened in BFUe cultures derived from thalassaemic patients, to ensure that their effects are reproduced in patient-derived cultures. The patients will be grouped according to their genetic background and starting HbF levels. The compound with the highest γ-globin reactivation potential will be used for in vivo screening in transgenic mice carring the human Αγ-gene with a micro-Locus Control Region (LCR)7 to establish γ-globin reactivation levels following induction in an animal model. Molecular mechanisms of action of the most efficient agent will be delineated by: a) Chromatin immunoprecipitations (ChIP) in treated and control BFUe cultures of healthy individuals and adult bone marrow of treated and control LCR-Aγ transgenic mice, to investigate acetylation, methylation, and binding of transcription factors to the γ-globin promoter and the LCR. b) Quantitative study of gene expression at the proteome level using the iTRAQ approach12 to investigate the effects in the proteome of treated and control BFUe cultures. The findings of the proposed project will be translated into novel therapies for β-thalassaemia by allowing us to make more educated choices on HbF inducers that merit study and by pointing towards future structural modifications to enhance their activity. Furthermore expression profiles at the proteome level, together with information on post translational modifications, will be useful for categorisation, prognosis, diagnosis and therapy of β-thalassaemias.

Η βήτα-θαλασσαιμία είναι μια από τις πιο συχνές κληρονομικές ασθένειες του αίματος κατά την οποία παρατηρείται μειωμένη ή καθόλου παραγωγή της βήτα αλυσίδας της αιμοσφαιρίνης. Η διαχείριση της βήτα-θαλασσαιμίας συμπεριλαμβάνει τακτικές μεταγγίσεις αίματος σε συνδυασμό με θεραπεία αποσιδήρωσης. Ωστόσο, αυτή η μέθοδος δεν είναι θεραπευτική και παρουσιάζει σοβαρή νοσηρότητα που σχετίζεται με υπερφόρτωση σιδήρου. Μεταλλάξεις που αυξάνουν την εμβρυϊκή αιμοσφαιρίνη (HbF) βελτιώνουν τα συμπτώματα της β-θαλασσαιμίας και δρεπανοκυτταρικής αναιμίας. Επομένως, η φαρμακολογική ενεργοποίηση των γονιδίων της γ-σφαιρίνης για την παραγωγή της εμβρυϊκής αιμοσφαιρίνης (HbF) είναι μια πολύ υποσχόμενη θεραπευτική προσέγγιση για τη θεραπεία της β-θαλασσαιμίας. Η εμβρυϊκή αιμοσφαιρίνη μπορεί να αντικαταστήσει την απούσα ενήλικη β-αιμοσφαιρίνη και να επιφέρει σημαντική βελτίωση των κλινικών συμπτωμάτων των ασθενών. Ωστόσο, οι χημικές ουσίες που χρησιμοποιούνται σήμερα για το σκοπό αυτό έχουν περιορισμένη εφαρμογή λόγω μέτριας θεραπευτικής ιδιότητας, μεταβλητής ανταπόκρισης ασθενών και πιθανών κυτταροτοξικών αποτελεσμάτων. Ως εκ τούτου, ο εντοπισμός νέων ουσιών που διεγείρουν την γ-σφαιρίνη είναι ζωτικής σημασίας σήμερα.
Με βάση τη λογοτεχνία βιβλιογραφία και προκαταρκτικές μελέτες στον Ανάδοχο Φορέα και PA3, πέντε χημικές ουσίες με σημαντική δράση όσον αφορά την επανενεργοποίησης της γ-σφαιρίνης έχουν επιλεγεί για να συμπεριληφθούν σε αυτό το έργο. Οι πέντε ουσίες, α) Lenalidomide, β) Angelicin, γ)Distamycin derivative 1071015 δ) 5-aza-2'-deoxycytidine και ε) Mithramycin, θα μελετηθούν ex vivo σε καλλιέργειες ερυθροβλαστικών κυττάρων (BFUe) από υγιή άτομα, ώστε να παρουσιαστεί μια ανεξάρτητη και άμεσα συγκρίσιμη μέτρηση της ικανότητάς τους για επαγωγή της HbF. Οι δύο ουσίες με την υψηλότερη επαγωγή αιμοσφαιρίνης και τα υψηλότερα ποσοστά επιβίωσης των κυττάρων,  θα μελετηθούν στη συνέχεια σε καλλιέργειες ερυθροβλαστικών κυττάρων από θαλασσαιμικούς ασθενείς, έτσι ώστε να διασφαλιστεί ότι η επίδραση των ουσιών αυτών μπορεί να αναπαραχθεί σε καλλιέργειες από ασθενείς. Οι ασθενείς θα ομαδοποιούνται ανάλογα με το γενετικό υπόβαθρό τους και αρχικά επίπεδα HbF. Η ουσία με τη μεγαλύτερη ικανότητα επανενεργοποίησης της γ-σφαιρίνης θα μελετηθεί in vivo σε διαγονιδιακό μοντέλο ποντικού που φέρει το ανθρώπινο Αγ-γονίδιο αμέσως μετά την περιοχή ελέγχου micro-Locus (LCR) για την επανενεργοποιήση της γ-σφαιρίνης μετά την εισαγωγή της ουσίας σε ζωικό μοντέλο. Ο μοριακός μηχανισμός της δράσης της πλέον αποτελεσματικής ουσίας θα μελετηθεί με: α) Ανοσοκατακρήμνιση χρωματίνης (ChIP) σε BFUe καλλιέργειες από υγιή άτομα, και σε μυελό των οστών των LCR-γ διαγονιδιακών ποντικιών με και χωρίς ουσία, για  να ερευνηθεί η  ακετυλίωση και μεθυλίωση των ιστονών και η σύνδεση των μεταγραφικών παραγόντων στον υποκινητή της γ-σφαιρίνης και του LCR. β) Ποσοτική μελέτη της γονιδιακής έκφρασης στο επίπεδο του πρωτεώματος χρησιμοποιώντας την μέθοδο iTRAQ για να διερευνηθούν οι επιπτώσεις στο πρωτέωμα καλλιεργειών  BFUe. Τα ευρήματα του προτεινόμενου έργου μπορούν να μεταφραστούν σε νέες θεραπείες για τη β-θαλασσαιμία, επιτρέποντας μας να κάνουμε πιο μελετημένες επιλογές για ουσίες που επάγουν την HbF. Επιπλέον το προφίλ έκφρασης στο πρωτεϊνικό επίπεδο, μαζί με πληροφορίες σχετικά με μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις, θα είναι χρήσιμο για την κατηγοριοποίηση, την πρόγνωση, τη διάγνωση και τη θεραπεία της β-θαλασσαιμίας.