Molecular Genetics Thalassaemia Department

ΥΠΗΡΕΣΙΕΣ, Διάγνωση Αιμολυτικών Αναιμιών με NGS

Σπάνιες Κληρονομικές Αιμολυτικές Αναιμίες: Αξιολόγηση και  Διάγνωση  με Αλληλούχηση Νέας Γενιάς NGS.
 
Οι κληρονομικές αιμολυτικές αναιμίες αποτελούν μία ομάδα σπάνιων ασθενειών, οι οποίες χαρακτηρίζονται από  πρόωρη καταστροφή των ερυθρών αιμοσφαιρίων (RBC) που προκαλείται από ανωμαλίες στη μεμβράνη των ερυθρών αιμοσφαιρίων, από ανεπάρκεια κάποιων ενζύμων στα ερυθρά αιμοσφαίρια ή από διαταραχές της αιμοσφαιρίνης. Ως εκ τούτου,  αποτελούν μια  ομάδα ετερογενών, γενετικά και φαινοτυπικά, διαταραχών. Τα κλινικά συμπτώματα ποικίλλουν από πολύ ήπια  έως πολύ σοβαρά προκαλώντας  ποικιλία επιπλοκών στην υγεία και ενδεχομένως να είναι και απειλητικά για τη ζωή. Τα πιο συνήθη είναι  αναιμία, κόπωση, ωχρότητα, σπληνομεγαλία, αρρυθμίες, διευρυμένη καρδία και καρδιακή ανεπάρκεια[1].
 
Οι κληρονομικές αιμολυτικές αναιμίες ταξινομούνται σε τρεις κύριες κατηγορίες, τις Μεμβρανοπάθειες, τις Αιμοσφαιρινοπάθειες και τις  Ενζυμοπάθειες. Αυτές περιλαμβάνουν μεταξύ άλλων τις ακόλουθες: Αιμοσφαιρινοπάθειες (β-θαλασσαιμία, αιμοσφαιρινοπάθεια Η, δρεπανοκυτταρική αναιμία),  Μεμβρανοπάθειες (Σφαιροκυττάρωση, Ελλειπτοκυττάρωση, Στοματοκυττάρωση) και Ενζυμοπάθειες (Διαταραχές των γλυκολυτικών ενζύμων των ερυθρών αιμοσφαιρίων όπως η έλλειψη του ενζύμου G-6-PD και η Ανεπάρκεια Πυρουβικής Κινάσης) [2]. 
 
Η συμβατική  διάγνωση πραγματοποιείται μέσω μιας σταδιακής διαδικασίας που συνδυάζει κλινικά και εργαστηριακά ευρήματα. Περιλαμβάνει μορφολογία RBC (Εικόνα 1), ανάλυση πρωτεϊνών μεμβράνης, ηλεκτροφόρηση Hb, μέτρηση επίπεδων ενζύμων. Κάποιες φορές η ακριβής διάγνωση αποτελεί πρόκληση αφού τα κλινικά χαρακτηριστικά μπορεί να αλληλοεπικαλύπτονται με περιπτώσεις από διαφορετικές αιτιολογίες και κατά συνέπεια να μην είναι εφικτή η διαφορική διάγνωση μεταξύ τους με βάση τις συμβατικές διαγνωστικές τεχνικές. 
 
Ο εντοπισμός μιας συγκεκριμένης αιτίας κληρονομικής αιμολυτικής αναιμίας απαιτεί εκτεταμένο έλεγχο. Η τελική διάγνωση μπορεί να είναι δύσκολη και μακροχρόνια, ιδιαίτερα όταν τα αποτελέσματα των αναλύσεων δεν συνάδουν μεταξύ τους ή δεν εντοπίζουν τις κοινές διαταραχές των ερυθρών αιμοσφαιρίων. Ως αποτέλεσμα, πολλοί ασθενείς με σπάνιες αιμολυτικές αναιμίες δεν έχουν ακριβή διάγνωση, κάτι που δυσκολεύει την αποτελεσματική διαχείρισή τους. 
 
Οι γενετικές ανωμαλίες  σε αυτές τις ασθένειες μπορεί να είναι πολύπλοκες, μπορεί να οφείλονται σε σύνθετη ετεροζυγωτία, και συχνά κληρονομούνται από ασυμπτωματικούς γονείς. Ορισμένες από αυτές τις ασθένειες προκαλούνται από μεταλλάξεις σε πολλά διαφορετικά γονίδια και κληρονομούνται με αυτοσωμικό υπολειπόμενο ή κυρίαρχο τρόπο. 
 
Οι τρέχουσες συμβατικές μοριακές διαγνωστικές αναλύσεις έχουν σχεδιαστεί για να προσδιορίσουν μόνο τις πιο κοινές μεταλλάξεις ή για να στοχεύσουν τα κύρια γονίδια αιμολυτικών αναιμιών με επιβλαβείς  μεταλλάξεις. Τα στοχευμένα γονίδια εξετάζονται ανεξάρτητα και απαιτούν πολλαπλές και διαφορετικές μοριακές δοκιμές για να καταλήξουν στο τελικό συμπέρασμα. Ενώ οι μέθοδοι αυτοί είναι αποτελεσματικοί στην ανίχνευση συγκεκριμένων κοινών μεταλλάξεων, δεν ισχύει το ίδιο στις περιπτώσεις που ο ασθενής έχει σπάνιες μεταλλάξεις.  Ακολουθώντας αυτή τη στρατηγική η οριστική διάγνωση μπορεί να είναι δύσκολη, παρατεταμένη και ίσως ανέφικτη, και την ίδια στιγμή δαπανηρή. Γι’ αυτό και η ανάγκη μιας περιεκτικής εξέτασης των αιμολυτικών διαταραχών γίνεται ακόμη πιο επιτακτική και ευρέως αποδεκτή.
 
Η δραστική έκρηξη στην εξέλιξη μοριακών τεχνολογιών συμπεριλαμβανομένης της Αλληλούχησης  Νέας Γενιάς/Next Generation Sequencing (NGS), μας ενέπνευσε να αξιοποιήσουμε και να αναπτύξουμε αυτή την  τεχνολογία ως προσέγγιση πρώτης γραμμής για την ανίχνευση μεταλλάξεων και προσδιορισμό νέων γονιδίων με επιβλαβείς μεταλλάξεις σε ασθενείς με αναιμία. Η Αλληλούχηση Νέας Γενιάς (NGS), με την υψηλή αναλυτική δύναμη και ευαισθησία, παρέχει μια οικονομικά αποδοτική και γρήγορη προσέγγιση στη μοριακή διάγνωση των αιμολυτικών αναιμιών μέσω εκτεταμένης και ταυτόχρονης αξιολόγησης μιας ομάδας γονιδίων που προκαλούν την ασθένεια[3]. 
 
Ως εκ τούτου, έχουμε σχεδιάσει και αναπτύξει ένα γενετικό τεστ για τον έλεγχο και διάγνωση κληρονομικών αιμολυτικών αναιμιών, το οποίο βασίζεται στην Αλληλούχηση Νέας Γενιάς NGS. Το NGS τεστ αποτελείται από ένα ολοκληρωμένο πάνελ υψηλής πυκνότητας που συνίσταται από 38 κοινά γονίδια που ενοχοποιούνται και δύνανται να είναι συνδεδεμένα με τις πιο κοινές κληρονομικές αιμολυτικές αναιμίες. Το NGS τεστ, το οποίο έχει αξιολογηθεί και επικυρωθεί για πλήρη εφαρμογή στη διαγνωστική ρουτίνα, είναι μια καινοτόμος δοκιμή, καθώς καλύπτει ταυτόχρονα ένα πάνελ γονιδίων για τις πιο κοινές κληρονομικές αιμολυτικές αναιμίες, επεκτείνοντας εξαιρετικά τη διαγνωστική ικανότητα και αποτελεσματικότητα (Εικόνα 2).  
 
Με την καινοτόμα στοχευμένη παράλληλη NGS ανάλυση θα επωφελούνται ασθενείς που έχουν φαινοτυπική ένδειξη κάποιου είδους αναιμία, όπως κληρονομική σφαιροκυττάρωση, ελλειπτοκυττάρωση, ξηροκυττάρωση, στοματοκυττάρωση κ.λ.π. ή έχουν οικογενειακό ιστορικό αναιμίας. Επιπροσθέτως, ασθενείς με συνυπάρχουσα μεμβρανοπάθεια, ενζυμοπάθεια ή/και αιμοσφαιρινοπάθεια, μπορούν να διαγνωστούν αποτελεσματικά χρησιμοποιώντας αυτή την τεχνολογία.  Θα προσφέρεται επίσης αξιολόγηση κινδύνου σε άτομα με οικογενειακό ιστορικό  αιμολυτικής νόσου ή σε οποιοδήποτε άτομο έχει κλινική εικόνα σύμφωνη με αιμολυτική νόσο.
 
Η διευρυμένη εφαρμογή της νέας τεχνολογίας θα αυξήσει τις γνώσεις μας για τις γενετικές και γονιδιωματικές διαφορές μεταξύ των ατόμων, οδηγώντας, σταδιακά, σε μια αλλαγή στην κλινική διαχείριση και το θεραπευτικό πρωτόκολλο, από μια πληθυσμιακή προσέγγιση σε εξατομικευμένη θεραπεία για τον κάθε ασθενή. Η ανάλυση αυτή θα παρέχει επίσης στους γενετικούς συμβούλους τις απαραίτητες γνώσεις και πληροφορίες για την παροχή ακριβέστερης συμβουλευτικής στους ασθενείς τους.
 
Το τμήμα Μοριακής Γενετικής Θαλασσαιμίας του Ινστιτούτου Νευρολογίας & Γενετικής Κύπρου με διευθύντρια την Δρ Μαρίνα Κλεάνθους, εφαρμόζει και προσφέρει τη νέα γενετική διαγνωστική μέθοδο NGS. Την διαγνωστική ομάδα απαρτίζουν η Δρ Θεσσαλία Παπασάββα, ο Γιώργος Χριστόπουλος, η Μιράντα Πέτρου, η Ξένια Φελέκη, και η Ελένη Καριτζή.  Στις δραστηριότητες του τμήματος συμμετέχουν η Δρ Στεφανία Μπύρου και Δρ Σαβάννα Ανδρέου. 
 
 
Δρ Θεσσαλία Παπασάββα
Associate Scientist
Molecular Geneticist
 
Τμήμα Μοριακής Γενετικής Θαλασσαιμίας
 
Βιβλιογραφία
  1. Tse, W.T. and S.E. Lux, Red blood cell membrane disorders. British journal of haematology, 1999. 104(1): p. 2-13.
  2. King, M.J. and A. Zanella, Hereditary red cell membrane disorders and laboratory diagnostic testing. Int J Lab Hematol, 2013. 35(3): p. 237-43.
  3. Agarwal, A.M., et al., Clinical utility of next-generation sequencing in the diagnosis of hereditary haemolytic anaemias. British journal of haematology, 2016. 174(5): p. 806-14.
  4. Kim, Y., J. Park, and M. Kim, Diagnostic approaches for inherited hemolytic anemia in the genetic era. br, 2017. 52(2): p. 84-94.
 
Εικόνα 1. Επίχρισμα περιφερικού αίματος κληρονομικής αιμολυτικής αναιμίας. (A) Κληρονομική σφαιροκυττάρωση, (Β) Κληρονομική ελλειπτοκυττάρωση, (Γ) Κληρονομική στοματοκυτταρωση, (Δ) β-θαλασσαιμία, (Ε) Δρεπανοκυτταρική αναιμία. Πηγή εικόνας: Kim et al, 2017[4]
 
 
Εικόνα 2. Λεπτομερής ανάλυση του αρχείου fastq ασθενούς με σφαιροκυττάρωση τύπου 4 ως προς τα 38 γονίδια του στοχευμένου NGS πάνελ σπάνιων αιμολυτικών αναιμιών. Συγκεκριμένα, στον πίνακα (πάνω μέρος) παρουσιάζονται όλες οι μεταλλαγές που εντοπίστηκαν μετά από σύγκριση με το γονιδίωμα αναφοράς και πληροφορίες που σχετίζονται με αυτές. Στο κάτω μέρος απεικονίζεται ένα γράφημα από το διαδικτυακό εργαλείο IGV όπου φαίνονται οι μεταλλαγές που εντοπίστηκαν στο γονίδιο SLC4A1 το οποίο σχετίζεται με σφαιροκυττάρωση τύπου 4, μεταξύ των οποίων και μία παθογόνος (κόκκινο χρώμα).   
 
Related Articles
winner